單純疱疹病毒（HSV）

服務詳情

服務類型

我們提供的HSV載體構建和病毒包裝服務如下：

• HSV載體克隆，使用BAC骨架或者BACYAC骨架
• HSV-1病毒包裝
• HSV-1擴增子載體克隆

HSV BACYAC骨架

雲舟生物自主研發(fā)的“BACYAC”骨架專門爲HSV載體克隆而設計。日刀該骨架整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）歌報的關鍵元件。BAC相關元件允許該載體可以在大腸杆菌中以BAC形式擴增黃章，而YAC相關元件允許該載體在釀酒酵母中複制計街BACYAC載體因此可靈活地在大腸杆菌系統和酵母系統中進(影會jìn)行載體擴增和序列修飾。

BACYAC骨架可以插入LacZ或EGFP報告基因以便于轉染算也細胞後(hòu)的識别。骨架上含有一對(duì)LoxP位點，可在C機飛re重組酶作用下拼接出最終的病毒基理南因組序列。

HSV BACYAC載體的基本設計如圖1所示。

圖1 含有EGFP和LacZ報告基因的BACYAC骨架下拍

TR_L/IR_L：長(cháng)片段側翼的末端和反向(x身的iàng)重複序列，通過(guò)“a”序列（黑色）重組連接并形自們成(chéng)4種(zhǒng)照湖異構體。

TR_S/IR_S：短片段側翼的末端和反向(xiàng)重複序列生員，通過(guò)“a”序列（黑色）重組連接并水新形成(chéng)4種(zhǒng)異畫通構體。

U_L/U_S：編碼HSV基因的特殊長(cháng)片段和短片段。

UL37/UL38：HSV UL37和UL38基因。UL37和UL38之間插入外源D體站NA可引起(qǐ)HSV毒力的微小變化。

LoxP：Cre重組酶作用的重組位點。兩服了(liǎng)個LoxP之間的序列可以被(bèi)C區到re重組酶剪切下來。

EGFP或LacZ報告基因： CMV啓動子驅動表達的EGFP和LacZ報告基因，用于識别山議轉染成(chéng)功的細胞。

BACYAC骨架：整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC）的載體骨架，可以在制學大腸杆菌中攜帶氯黴素抗性基因選擇性擴增，也可以在釀酒酵母中使用His3自噬選業長擇标記進(jìn)行擴增。

我們可以構建多種(zhǒng)重組HSV BAC載體。此外頻少我們也提供基于BAC修飾原理的HSV突變服務。對(duì)H舊動SV病毒複制相關基因進(jìn)行序列删除或點突變開生可以制備複制缺陷型HSV；對(duì)HSV非關鍵基因進(jìn)行序列删除好謝或點突變可以制備減毒型HSV。

HSV擴增子載體

雲舟生物的HSV-1擴增子載體包含最小病毒基因組跳化序列：複制起(qǐ)點（oriS）、包裝信号序列（pac）以及一個或多個還通目的基因。通過(guò)利用輔助少票質粒（攜帶有整個HSV-1基因組但是無包歌都裝信号序列的BACYAC載體），身場擴增子載體可以包裝出複制缺陷型的喝煙但是具備感染能(néng)力的員體HSV病毒顆粒。

HSV擴增子載體的基本設計如圖2所示。

圖2 HSV-1擴增子載體

Promoter：啓動子序列，驅動目的基因表達。

Kozak：Kozak共有序列，放置于ORF前端有助于原核細胞中的翻譯起(唱個qǐ)始。

ORF：目的基因的開(kāi)放閱讀框。

BGH pA: 牛生長(cháng)激素多聚腺苷酸少個信号序列（Bovine growth hormone pol現愛yadenylation signa飛歌l）。由啓動子驅動的轉錄過(guò)程將(jiāng)在該序列處終止。著間

HSV-1 pac：HSV-1包裝信号，在病毒DNA包裝進(樂行jìn)入病毒顆粒過(guò)程中發(fā)揮作用。

Ampicillin：氨苄青黴素抗性基因。攜帶該基因的質粒在E. coli中可以使用氨苄青黴低很素選擇性擴增。

pUC ori：pUC複制起(qǐ)點，攜帶該元件的質粒可以在E. coli中高拷貝複子懂制。

oriS：HSV-1 DNA複制起(qǐ)點。攜帶該元件的質粒以多連體DNA形式包照微裝進(jìn)入HSV-1病毒顆粒。

IE4/5：HSV-1 ICP22和ICP47中早期基因啓動子。該啓動子匠購的激活取決于順式HSV-1包膜蛋白VP1能在6。該啓動子可以驅動下遊标記基因表達，同時(shí)也作爲玩學激活oriS功能(néng)的轉國日錄調控序列。

Marker：标記基因（如EGFP、LacZ），用于分辨轉染成(chéng)這購功的細胞

SV40 early pA：猿猴空泡病毒40早期多聚腺苷酸信号序列（Simian vacuol弟紅ating virus 40 e校兵arly polyadenylation signal），有時如助于上遊ORF序列的轉錄中止。

運輸與存儲

我們的HSV病毒保存于HBSS了影緩沖液，并以幹冰形式運輸。接收到病毒後(hòu得空)，HSV可以在-80°C長(cháng)期存儲（文電可至少穩定存儲6個月），或者在-20°C存儲一周。HSV雪話的保質期約爲1年。請避免反複凍融HSV司線以避免顯著的滴度下降。

HSV制備與質量控制

HSV包裝流程如圖3所示。攜帶目的基因的BACYAC質粒載體與房公Cre表達質粒共轉染包裝細胞。篩選BACYAC骨架移除後(hò腦微u)的無熒光的噬斑以純化病毒。然後(h長購òu)用篩選後(hòu)的噬斑進(jìn)行HSV病毒擴唱很增。對(duì)于超純化HSV，病毒顆粒經(jīng制大)過(guò)進(jìn)一步的蔗糖密度梯度離心以獲得純化和濃縮不雨。

圖3 典型的HSV包裝流程，使用BACYAC骨架并最終將(jiāng)其移除。

對(duì)于每一個生産的重組HSV病毒，火如質量控制包括滴度檢測、無菌測試、支原體檢測等在但。如果HSV病毒載體表達熒光蛋白，則我們會(hu間線ì)進(jìn)行熒光轉導測試。如果HS關用V病毒載體含有藥篩标記，我們也會(huì)在轉導測試後(hòu)伴随進(鐵我jìn)行藥篩測試。此外，對(duì)于超村就純化HSV，我們會(huì)進(湖媽jìn)行内毒素檢測。

試驗驗證

我們的HSV載體經(jīng)詳盡驗證可以穩定用于生産活病毒。圖4與圖5分别顯示使用我們的BACYAC載體成(ché空問ng)功包裝出的野生型HSV病毒顆海化粒以及随後(hòu)用其轉導靶細胞的愛議效果。

圖4 攜帶野生型HSV-1（KOS毒株）全長(cháng市風)基因組序列的BACYAC載體（含有EGFP報告輛術基因）轉染BHK21細胞。轉染後(hò科樂u)48小時(shí)進(jìn)行拍照。細胞病變效應（Cytop匠年athic effect，CPE年章）見于紅色箭頭處，死細胞發(fā)森頻生團聚并且呈現出球形形态和反光率增強現象。這(zhè)種(zhǒng)現象可用呢算于指示活病毒的存在。放大倍數：100X。左：明場務站。右：EGFP。

圖5 使用我們生産的HSV病毒顆粒（KO子森S毒株）轉導BHK21細胞。轉導後(hòu)48小時(shí)進跳影(jìn)行拍攝。放大倍數：100X。左：明場。右：EGFP。

HSV在基因治療中的優勢

HSV是基因組爲雙鏈DNA的包膜病毒，且畫村具備多項應用于基因治療的優勢：

廣泛的組織嗜性：HSV可以轉導分裂和非分裂細胞。HSV同時(sh喝生í)也是天然的嗜神經(jīng)病毒村劇，可以借助軸突逆行運輸，因此通過(g線舊uò)感染注射位點的神經(jīng)末梢即可進(jìn)行基因遞看海送。HSV由此也是理想的治療特定神經(jīng)疾病的理一到想載體。

潛伏感染：HSV在神經(jīng)元中長(ch黑數áng)期保持潛伏狀态，不會(huì)産生顯著副作用。這(下訊zhè)種(zhǒng)特點讓HSV可以的農逃避宿主免疫系統并且可以在宿主細胞的生命周期中長(chá老腦ng)期留存。HSV具有在神經(jīng市行)元中穩定表達目的基因的優勢，特别是對(d笑開uì)于那些要求長(cháng)期表達的研究。

最小化插入突變風險：當保持潛伏方式感染狀态時(shí)，HS說票V以遊離體的形式存在，不整合宿主基因組，因此最小化了插入突變的風險。

可以使用組織培養基擴增：HSV可以應用組織培養基擴增，方法簡單且顯示出在多種(數工zhǒng)動物模型形成(chéng)潛伏感染的能(néng)力。

高病毒滴度：通過(guò)包裝獲得的HSV病毒滴度很高，可以高效轉導靶細胞。

載體容量大：HSV擁有巨大的病毒基因組，包含超過(guò)80個基些了因，其中一些對(duì)于病毒複制是非飛近關鍵的。這(zhè)種(zhǒng)了煙特點給研究者提供了高度的操作靈活性，例如可農月以删除掉非關鍵基因并利用空間插入大片段或多個目的基因。

常用的HSV載體

HSV載體大緻可以劃分爲以下幾類：

HSV BAC 載體

HSV BAC載體是通過(guò)在真核細胞中使用同木時源重組方式將(jiāng)BAC骨架插入HSV基因組的訊友方式制備的。選擇标記如EGFP有助于正确純化出插入了BAC序列的重組病風鐵毒。疱疹病毒基因組在宿主細胞中傾向(xiàng)于都河形成(chéng)環狀DNA，并在細胞核内部産生複制中間産物。這(zh頻從è)些DNA將(jiāng)被(bèi)分離出來并用以轉化大腸杆菌理看。BAC骨架上含有抗生素抗性基因，有助于在大腸杆菌中選擇性擴增HSV BAC載知購體。最後(hòu)的步驟則是從大腸杆菌中分離出HSV BAC載體，并使用酶切和器綠測序分析進(jìn)行質檢。通過(guò)質檢的HSV要個 BAC載體將(jiāng)被(bèi)轉染至容許性細胞用于生産活病毒。

HSV病毒基因組巨大，使用常規質粒載體克隆HSV基因組是不合适的。BAC市師載體另一方面(miàn)由于可月坐以插入大片段DNA序列和較慢的複制速率的特點，女師因此是HSV研究的更佳選擇。使用HSV BAC在大腸費森杆菌中擴增，對(duì)比使用容許性細胞擴增臨床個刀分離株的方式更能(néng)保障病毒序列的穩定性服人。

盡管HSV BAC具備上述所示的多種(zhǒng)優點，但是也存水黑在一些不足之處值得考慮。使用HSV BAC需要首先檢查船海其序列不含有由于病毒基因組重複序列天然的不穩定林年性造成(chéng)的突變。此外飛鐘，插入BAC骨架的HSV基因組睡費造成(chéng)的病毒基因組大小增加也會(huì)抑制病毒生長(cháng船知)。因此，理想的方法是設計HSV BAC載體時(shí)在BAC兩(l姐房iǎng)側引入loxP或FRT位你時點，允許必要時(shí)分别通過(分裡guò)Cre-或者Flp-重組系統移除BAC骨架。

HSV擴增子載體

擴增子是基于HSV-1的質粒載體，制好包含一個或多個目的基因以及最小病山長毒基因組序列。在HSV-1輔助病毒或者HSV-1基因組克隆提供議讀的順式元件輔助下，擴增子序列可以被(bèi)包裝進外黑(jìn)HSV活病毒顆粒。擴增子隻含有兩(liǎn電上g)段病毒序列：一個是oriS複制起(qǐ)點，允許病毒器服病毒在包裝細胞中複制；另一個是p裡短ac序列，即包裝信号序列，在病毒的包裝過(guò)程中起(qǐ)作用。HSV病是北毒顆粒組分來自于擴增子基因組。擴增子使用類似滾環複制的機制進(jì吃空n)行複制，與野生型HSV-1的頭尾相連的多連體DNA相似，最終生成(c生人héng)串聯形式的含有多個擴增子的信機重複序列。

擴增子載體具備多種(zhǒng)用于基因轉染工具鐘章的優點，例如極大的載體容量（可達150 kb），易于克隆，以及可以轉染大量類看為型的細胞和較高的轉導效率，此外，病毒飛月蛋白編碼序列的缺失導緻擴增子載體轉染細胞核組織後(hòu)完路從全無毒性和無緻病性。缺少病毒基因的擴增子載體同時我雜(shí)也可以最小化其被(bèi)宿主細胞中潛伏的病毒基因組重新激活見坐或發(fā)生序列重組的機會(huì)。

長(cháng)期以來，使用擴增子要影進(jìn)行基因治療的主要瓶頸在于生産高滴度的擴增子病毒時(s購司hí)易攜帶有輔助病毒成(chéng)分。被(bèi女分)輔助病毒污染的擴增子病毒懸液在應用于基因治療時(shí)會(hu錢司ì)導緻潛在的細胞毒性和炎症反應，志道因此是不被(bèi)接受的。開(kāi)發(fā)無輔市腦助病毒的包裝系統，比如使用包含HSV-1基因組但是移新放除了包裝信号序列的一組重疊的黏粒（Cosmid）或資地者一個BAC載體來代替輔助病毒用于包裝，能(néng)夠很好(hǎ區對o)地克服這(zhè)種(zhǒng)污染問題。這(zhè師公)種(zhǒng)方法可以生産出無輔助病毒成(chéng和用)分的擴增子病毒懸液，但是制備的病毒滴度并不高。另一種(zhǒ來熱ng)方法是，使用Cre-lox技術在病毒書體生産細胞中删除輔助病毒的包裝信号序列，從而獲得具備更低輔助病毒訊風污染的高滴度擴增子病毒。然而此種(zhǒng)這街方法仍然包含極低水平的輔助病毒污染，可能(n女的éng)難以應用于某些特定的基因治療領域。

HSV載體的主要應用

重組HSV載體在基因治療領域應用多樣(yàng)，主要有以下幾種(數校zhǒng)研究場景：

HSV作爲溶瘤病毒

HSV-1在溶瘤病毒療法應用方面(miàn)，由于以下幾個因素銀務而具有相當的潛力。首先HSV-1具有很強感染性，在10小時(shí)内即可完是腦成(chéng)其整個複制周期并釋放數千個子代病毒顆粒，這(zhè)比腺病遠鐘毒等其它的常見病毒所需的時(shí)間機小要短得多。除了細胞外擴散外，HSV-1病毒顆粒還(頻呢hái)可以通過(guò)細胞連接的方式子謝從一個細胞傳導到另一個細胞，這(zhè)有利于病毒在實體瘤内高效傳播。子自此外，HSV-1已被(bèi)證明筆習可有效感染多種(zhǒng)實驗動物，因此非常适合筆廠體内臨床前研究。

經(jīng)過(guò)專門設計的減毒HSV溶瘤病毒可以選這西擇性地在腫瘤細胞中複制并將(jiāng)其殺死，但是不能鐵愛(néng)在正常細胞中生長(cháng)。這(zhè)樣(yàng)的HS跳資V可以通過(guò)删除正常細胞中病毒複制所必需唱訊但對(duì)腫瘤細胞不是必需的基因來産生化算。此外，這(zhè)種(zhǒng)HSV的腫瘤殺傷效果還(hái)可以兵又通過(guò)攜帶抗癌基因或者票暗激活化療試劑的基因來進(jìn)一步增強。

2015年，FDA批準了HSV-1溶瘤病毒藥物Talimogen要時e Laherparepvec（TVEC），目前用于治療黑色素瘤。TV件裡EC删除了病毒基因ICP34.5和I作門CP47，使其在正常細胞中無法複制但是可以激活免妹風疫系統。TVEC的溶瘤潛力還(hái)因爲其過(gu北北ò)表達人粒細胞巨噬細胞刺激因子（G答區M-CSF）而得到額外增強。GM-CSF基因通過(gu些相ò)增強樹突狀細胞的遷移和成(chéng)熟來進(jìn)一舞間步激活免疫系統。

除了減毒病毒載體，複制缺陷型的HSV也可以用公友于治療多種(zhǒng)癌症。該方法主要原數城理是利用複制缺陷型HSV來驅動細胞自殺基因（例如胸苷激雨月酶）或者其它治療潛力的基因（例如TNF-α）在雜謝腫瘤細胞内表達從而達到抑制腫瘤生長(cháng)的目的數生。

HSV作爲疫苗

HSV在用于抗病毒和抗細菌疫苗研制方面(miàn)擁有以下幾個優勢：1、理就可用多種(zhǒng)途徑給藥激活宿主免疫系統；2、務術病毒基因組在宿主細胞中保持遊離體形式，不整合宿主基因組； 3、HSV基因組房笑中表達TK基因可以將(jiāng)無細胞毒性的藥物，比如Ga唱分nciclovir，可以被(bèi)轉變成(c站大héng)有細胞毒性的代謝物以殺死被(bèi)病毒感染的細胞，同知時時(shí)不造成(chéng)副作用。實際上，無論是使用HSV-B志海AC、擴增子載體、複制缺陷型HSV還(頻自hái)是減毒HSV，在應用于抗擊多種(zhǒng)病原體的疫苗商看時(shí)均具有良好(hǎo)的表現。

減毒HSV特别适用于開(kāi)發(fā)抗HSV疫苗，這(zhè)是因爲它們請員爲宿主的免疫系統提供了接觸多種(zh著笑ǒng)類型的病毒抗原的機會(huì)，從而可以激活細胞免疫和體液免間志疫。此外，與非活性疫苗或者僅表達病毒特定亞基長頻的疫苗載體相比，減毒活疫苗可以提供更長(器一cháng)期的有效保護。

此外，HSV疫苗的開(kāi)發(fā)是有一定緊迫性的，鐵關這(zhè)是因爲全世界人口中有很大一部分行那有感染過(guò)HSV-1或HSV-2，但是目前兵離尚未有FDA批準的疫苗可用于治療這微家(zhè)兩(liǎng)種(zhǒ看還ng)病毒。VC2是一種(zhǒng)在開(kāi)發(fā)時(shí花爸)對(duì)病毒糖蛋白gk和膜蛋白UL20進(jìn)行了部分删除的減關們毒活HSV-1病毒，當前已經(jīng)在HSV-1和HSV-2感染的海議動物模型中測試并表現出良好(hǎo)的應用潛務金力。

包含删除突變的複制缺陷型HSV（删除了病毒複市放制所必需的以及表達特異性外來抗原的基因）在作著友爲疫苗注射各種(zhǒng)病毒或細菌感染的動物模型去看中，表現出持久誘導激活免疫反應的特點。

此外，在使用小鼠模型的一些臨床前研究中，擴增子載體作爲治療性疫苗已你爸廣泛用于治療癌症、微生物感染以及神經綠不(jīng)疾病。當前，還(hái)需要在其他動物模型中評估HSV疫苗的免疫月媽原性，包括那些已經(jīng)存在HSV免疫的動物嗎現模型。

HSV作爲基因遞送載體

HSV擴增子載體是基于HSV-1設計的，但是隻包含一個或多生費個目的基因以及最小病毒基因組序列。HSV擴增子載體由于其天然的神經嗎舊(jīng)嗜性、極大的裝載能(néng)力（可達150 kb）、低毒性以及在吃讀病毒基因組序列在靶細胞内以遊離體存在的特點，特别适合作爲針對(d見下uì)神經(jīng)元的進(jìn)行基車開因遞送。

當前HSV擴增子載體廣泛用于以下領域研術習究：1、神經(jīng)退行性疾病，例如阿爾茨海外山默症和帕金森疾病；2、神經(jīng)精神異常，包括抑郁和上瘾；3、商土治療方法中需要將(jiāng)治療性基因導入神經(jīng)系統的疾小習病，例如缺血性腦卒中。此外，由于擴增子載體能(néng)夠感染多西下種(zhǒng)分裂細胞系，并且與舊了傳統質粒轉染相比，HSV擴增子載體更容易感染細胞，因此擴增子載體非技體常适合體外藥理學(xué)研究。

通過(guò)删除病毒複制所必需的基因以顯著降低細胞毒性，複制缺陷型的HS白身V也是一種(zhǒng)基因遞送載體被(bèi)應用于基因治療。這(開他zhè)些HSV由于多個基因的缺失，其裝載能(nén水計g)力也到了提升，使得它們能(néng)夠攜帶多個獨立的基因表達盒，而這(zh年妹è)是對(duì)用于複合基因治療的載體的小爸典型要求。

因此，複制缺陷型HSV已廣泛用于多種(zhǒng)基因治療研究，包括慢性疼痛、行老帕金森疾病、脊髓損傷以及溶酶體儲存障礙等。NP2是你喝一種(zhǒng)表達人前腦啡肽（Preproen和舞kephalin，PENK）的複制缺陷型HSV，在治療疼痛的年樂一期臨床試驗中顯示出良好(hǎo)的結果。

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HSV病毒在基因治療中的應用

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