哺乳動物基因LSL條件性表達piggyBac載體

概述

PiggyBac質粒基因表達載體系統利用討有LoxP-Stop-LoxP（LSL）表達盒，在哺乳動物細胞和木朋動物體内實現Cre介導的條件性基因激活表達。LS時到L表達盒包含三個重複的SV40 polyA，序列兩(liǎng)端爲LoxP車紙位點。用戶選擇的啓動子位于LSL表達盒的上遊，而用戶感興趣的基好問因位于其下遊。在Cre重組酶不存在的情況下，該表達盒完全阻斷了目的基因的正常你來表達；當將(jiāng)Cre引入攜帶該載體鄉煙的細胞中時(shí)，目的基因上遊的LSL表達盒將(店了jiāng)會(huì)被(bèi)删除，從而目的基因能船麗(néng)夠在用戶選擇的啓動子下被(bèi)永久激活表達。

該載體不僅适用于體外細胞培養，更适用于轉基因動物離自模型的構建。當攜帶這(zhè)種(zhǒng)載體的轉基因動物與攜帶組織特異拍高性表達Cre的轉基因動物雜交時(sh路女í)，産生的動物後(hòu)代將(得我jiāng)在特定的細胞中組織化問特異性表達Cre，從而啓動目的基因在該特定細胞中組織特異性表達。

在細胞培養中使用該載體系統時(shí)，可也姐將(jiāng)抗生素或熒光标記添樂要加到載體中，使轉染後(hòu)的細胞可被(bèi)篩選或可示蹤以便于分離城知出已永久整合載體的細胞。

PiggyBac系統包含兩(liǎng)個組分，公器一個組分爲PBase轉座酶（通常爲表達PBase的IVT影理 mRNA）；另一個組分被(bèi)稱爲轉座子質粒，包含兩(liǎng)了吧個末端重複序列（TR）以及兩(liǎng)者錯吧之間的被(bèi)轉座區域，需要被(bèi)轉座到宿主基因弟開組中的目的基因就(jiù)克隆在這(zhè)個區域。

當表達PBase的IVT mRNA和轉座子質粒共轉染靶事花細胞時(shí)，PBase 信朋IVT mRNA産生的轉座酶將(jiā村術ng)會(huì)識别轉座子的兩(liǎng)個通能TR元件，然後(hòu)將(jiāng)西黃被(bèi)轉座區和兩(liǎn大北g)個TR元件插入到宿主基因組中。轉座插入通常發(視用fā)生在包含TTAA序列的宿主染色體位點，并在轉座子兩(liǎng)側出現暗司TTAA重複序列。

PiggyBac屬于II類轉座子，通過(guò)“剪紅船切—粘貼”的機制移動，從一個地文綠方轉座到另一個地方，而不留下序列本身（恰好(hǎo)相反，I類轉座子能地是通過(guò)“複制—粘貼”的方式移動）。由于輔助質粒是通過門習(guò)瞬時(shí)轉染進討窗(jìn)入宿主細胞的，故會(huì)逐漸丢失。随著(zh們謝e)輔助質粒的丢失，轉座子在宿主基因組中變成(chéng)了永久整跳日合。當這(zhè)些宿主細胞再次被(bèi)輔助還看質粒轉染，整合的轉座子會(huì)再次通過(guò)“剪切—粘貼”的機制雜看移動。

關于該載體系統和Cre介導重組的更多信息，樂路請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Mol Cell Biochem. 354:301 (2011)	Review of piggyBac
Cell. 122:473 (2005)	Efficient transposition of the piggyB雜都ac (PB) transposon in mamma做說lian cells and mice
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亮點

該載體是爲在哺乳動物細胞和動物體内實現Cre介導的條件性基因又地表達而設計的。目的基因的表達最初是沉默的，但通過(guò)與Cre重日照組酶的共表達後(hòu)，目的基因上遊票爸的3x SV40 pA將(jiāng)唱唱會(huì)删除，從而目的基因能(néng)夠在用戶選暗服擇的啓動子下被(bèi)永久激活表什湖達。

優勢

基因的穩定激活：經(jīng)過(guò)Cre重組酶處理後(hòu)，阻斷下遊大從基因轉錄的3x SV40 pA將(j風資iāng)被(bèi)永久删除，随後(hòu)客戶選自子擇的啓動子能(néng)夠驅動的目的基因的正常表達

外源基因的永久整合：常規質粒轉染隻能(néng)實現外源基因的瞬頻不時(shí)表達，這(zhè)種(zhǒng)外源基因會(hu上習ì)随著(zhe)宿主細胞的分裂而不斷丢失，在快速分裂的做公細胞中顯得尤爲顯著。相反，將(jiāng)PiggyBac轉座子載體和輔小暗助質粒一起(qǐ)轉染到哺乳動物細胞中，由于轉座子在轉座酶的作用下，目的基因能商計(néng)穩定地整合到宿主細胞的染色體中，算站從而實現轉座子載體上攜帶的目的基因在宿主細胞中永久表科到達。

技術簡單：通過(guò)常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jì笑不n)行病毒包裝，過(guò)程更簡單。

載體容量大：我們的轉座子載體總容量可達30和錢 kb，其中質粒骨架隻占3 kb，有足夠大的容量可以放置客戶所感興趣的序列。

不足之處

轉染細胞類型受限：PiggyBac載體進(jìn)入細胞依賴于轉染。不同類型的細章鐘胞，其轉染效率差異非常大。非分裂細胞話要通常比分裂細胞更難轉染，原代細胞比永生件報化細胞更難轉染，一些重要的細胞類男錯型轉染難度更大，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉染主要局限于體光影外應用，很少應用于體内實驗（但可以應用于轉基因動物模型制備）。以上業城因素在一定程度上制約了PiggyBac系統的應用。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. When a 照資DNA sequence is flanked by請冷 two ITRs, the piggyBac transpose can 筆中recognize them, and insert物生 the flanked regio和科n including the two I訊生TRs into the host geno票物me.

Promoter: The promoter that will dri通子ve expression of your gene of intere南他st after treatment with Cre r男如ecombinase.

LoxP: Recombination site for Cre recombin坐坐ase. When Cre is present the reg土麗ion flanked by the t會車wo LoxP sites will be excised.為媽

3x SV40 late pA: Repeats of the 木女simian virus 40 late polyadenylation si理為gnal. This terminates trans白生cription, preventing expression of離新 the downstream gene of i話農nterest prior to excision with 頻場LoxP-flanked region with Cre.

Kozak: Kozak consensus sequence. It船空 is placed in front o能員f the start codon of the ORF of i線慢nterest because it is believ件些ed to facilitate translation init現懂iation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your村也 gene of interest i舊頻s placed here.

rBG pA: Rabbit β-globin polyadenyla電東tion signal. It facilitates transc制木riptional termination of the ups錢短tream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early笑民 promoter. It drives the u們跳biquitous expression of th對雨e downstream marker gene票笑.

Marker: A drug selection gene (such as neom放中ycin resistance), a visually det慢地ectable gene (such as EGFP)時短, or a dual-reporter gene (such as EGFP習地/Neo). This allows cells t拿鐘ransduced with the vector to be selecte還到d and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hor匠友mone polyadenylation. It f開低acilitates transcri快要ptional termina長家tion of the ups跳西tream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance ge快妹ne. It allows the plasm綠問id to be maintained by ampicil都廠lin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Pla綠文smids carrying th少要is origin exist in high copy num樂照bers in E. coli.

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