Sleeping Beauty轉座載體

概述

我們的睡美人（Sleeping beauty）光東轉座載體系統可以高效地將(jiāng)外源DNA插入大雨宿主細胞基因組。該系統在技術上十分簡潔，僅需要進(jìn)行質粒轉染（兵我無需病毒轉導）即可永久性地對(duì)宿主細胞基因組插入您的答金目的基因。

該載體的轉座子系統來源于Tc1/mariner轉座子超家族，知銀一開(kāi)始是從魚類基因組分離出來，紙是并且經(jīng)過(guò)了大量的嗎但累積突變已失去轉座子活性。睡美人轉懂場座子通過(guò)移除鲑魚基因組的Tc費服1/mariner轉座子上的這(zhè)些失活突變，重新構築事服出有活性的轉座子。該方法合成(chéng)的轉座子提供了一種鐘為(zhǒng)在脊椎動物中高效地進工嗎(jìn)行基因轉導和插入突變的方法。

睡美人轉座載體系統包含兩(liǎng)自離個組分。一個組分是Sleeping bea術森uty轉座酶（通常爲表達Sleeping用市 beauty轉座酶的IVT m章醫RNA）。另一個組分則是轉座子載體，包含由兩(liǎng)個反錯裡向(xiàng)/正向(xiàng)重複序列（IR/D山女R）包圍的轉座子區域。需要被(bèi)遞送至宿主細胞的基因被(做男bèi)克隆至該區域。

表達Sleeping beauty轉座酶的I做書VT mRNA和轉座子載體共轉染至靶細胞時(shí)，IVT mRNA表達對聽的轉座酶會(huì)識别IR/DR序列，然後(hòu)將(j門門iāng)兩(liǎng)個IR/DR序列了習之間的區域作爲轉座子插入宿主基因組上的TA二核苷酸位點。

睡美人轉座子時(shí)II型轉座子，這(zh老外è)意味著(zhe)其遵循剪切-粘貼的轉座機制，從一個地方話姐轉移序列至另一個地方不會(huì)留下多餘的基因拷貝（I型轉座子則遵循房國複制-粘貼機制）。由于輔助載體是瞬時(shí)轉染的，會(huì)南技随著(zhe)時(shí)間逐漸丢失。伴随輔助載體的丢失，插入宿主基因組的著妹轉座子將(jiāng)變成(chéng)永久性的。如果此時(shí)再次金影轉染輔助載體，轉座子則可以從宿主基因組中剪切出來，且不會木年(huì)在基因組上留有痕迹。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Cell. 91:501 (1997)	Molecular reconstruction of the sleep那對ing beauty transposon
Mol Ther. 8:108 (2003)	Gene transfer into genome of拍著 human cells by sleep答銀ing beauty transposon
Mol Ther. 9:147 (2004)	Review on biology &街但 applications of sleeping be玩懂auty transposon

亮點

我們的睡美人轉座子質粒與其輔助載體經(j雨街īng)過(guò)優化，在大腸杆菌中以高拷貝數方式複制，并且可以有效轉厭知染範圍廣泛的靶細胞以及高水平表達載體上攜帶的目的基因。

優勢

轉座子DNA永久整合：傳統的質粒瞬轉，轉染的質粒再宿是用主細胞中會(huì)逐漸丢失，特别是河書分裂型的細胞。但是使用睡美人轉座子載體連同輔助載體共轉染哺乳動物細胞可以實現轉物吃座子DNA在宿主細胞基因組的永久整合。

技術簡單：常規轉染即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病費科毒包裝，過(guò)程更簡單。

不足之處

可轉染的細胞類型受限：不同類型細胞的質粒轉染效率差異很大。非分裂細胞比分裂細胞更難轉染，原代細亮小胞比永生化細胞系更難轉染。一些重要的細胞類型長舞更是難以轉染，如神經(jīng)元和胰島β細胞。另外，質粒轉火森染局限于體外細胞實驗，很少運用到活體實姐近驗。這(zhè)些問題限制了睡美人轉座子載體系統的應用黑街。

轉座子容量有限：轉座子的容量需在1.9 – 7.2 kb之間，超出該長(cháng)公放度的轉座子其轉座效率會(huì)降低。

載體關鍵元件

IR/DR(L): Inverted/direct repeat樹村s of sleeping beauty transposon (Left).用熱 Recognized by sleeping be錯銀auty transposase; DNA flanked by IR/DR(電低L) and IR/DR(R) can be transposed b如畫y sleeping beauty tran低妹sposase into TA 唱分dinucleotide sites.

Promoter: The promoter driving木信 your gene of inter湖筆est is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequenc慢近e. It is placed in front of the start筆要 codon of the ORF of 木土interest because it is believed to fa玩慢cilitate translation initiation就懂 in eukaryotes.

ORF: The open reading fr男但ame of your gene of in理師terest is placed 花紙here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenyl舞還ation signal. It facilitates transcrip業件tional termination of 書笑the upstream ORF.

IR/DR(R): Inverted/dir可子ect repeats of sleeping beauty tra鐘媽nsposon (Right).近分 Recognized by sleeping beauty 事車transposase; DNA flanked by 呢在IR/DR(L) and IR做雪/DR(R) can be transposed by 笑窗sleeping beauty transposase int個亮o TA dinucleoti訊說de sites.

TATA: TA dinucleotide base-pa秒開irs. Increases sleeping beauty tr拍事ansposition efficiency外服.

Ampicillin: Ampicillin resistance gen如見e. It allows the plasmid to be main冷體tained by ampicillin你照 selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of匠他 replication. Plasmids carrying thi你多s origin exist in high cop河電y numbers in E. coli姐件.

Representative vec黑鄉tor design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9391ssw	pSB[Exp]-CMV>EGFP(ns):T2A:Puro	A Sleeping Beauty transposon vector co-門妹expressing EGFP場白 and puromycin resistance driven 城懂by a CMV promoter.
VB231214-1668sem	pSB[Exp]-CAG>樹兵;hRHO[NM_000539.3]	A Sleeping Beauty transposon ge得女ne expression vector encoding human長能 rhodopsin, a gene that自河 is crucial for vis黃動ion especially in一書 low light, driven by東員 a CAG promoter.
VB010000-9366jzq	pRP[Exp]-CMV>SB100X	A mammalian gene expre年地ssion vector encoding a hi愛船gh-efficiency Sleeping B睡他eauty transposase (SB100X高光).

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