細菌蛋白表達載體pET

概述

pET載體系統是用于在大腸杆菌中表達重組蛋白的功能(néng)強開了大且廣泛使用的系統，載體上的噬菌店銀體T7強啓動子能(néng)夠調控目的基因的轉錄和翻譯。細胞内暗刀存在T7 RNA聚合酶時(shí)，重組蛋白的表達被頻校(bèi)激活。當處于完全誘導狀态時(shí)，幾乎所有細胞資源都(dōu)會會呢(huì)緻力于表達目的蛋白，僅需幾個小時(shí)的誘導，目的章呢蛋白的表達量就(jiù)可以占細胞總蛋白的一半。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文空司獻。

參考文獻	主題
Methods Enzymol. 185:60-8服購9 (1990)	Use of T7 RNA polymerase to direct e相身xpression of cloned genes.
J Mol Biol. 219:45 (1991)	Development of the T7la聽在c promoter system.

亮點

首先，在缺乏T7 RNA聚合酶基因的視有宿主菌中，將(jiāng)目的基因克隆到pET載體上，這(zh爸火è)樣(yàng)可以以防止重組毒能草性蛋白的表達引起(qǐ)的質粒不穩定性。之後(hòu)，重組蛋白可以通過(也服guò)兩(liǎng)種(zhǒng)方式表達：一種(zhǒng)是工輛將(jiāng)攜帶T7 RNA聚合酶基因的噬菌體（例如λCE6噬菌體少場）感染宿主菌；更常見的另外一種(zhǒng)是將(jiāng)pET質粒從頻轉移到由LacUV5啓動子驅動T7 RNA聚合道可酶基因表達的細菌宿主菌中，通過外照(guò)向(xiàng)菌液中加入乳糖類似討生物IPTG來誘導T7聚合酶的表達。

pET載體在宿主大腸杆菌中以低拷貝質粒存在，可減少誘導前的洩門技漏表達。該載體利用T7lac啓動子系統對(duì)基因表達進(jìn分木)行嚴格調控。T7啓動子可以被(bèi)T7 RNA聚合酶作用計中以驅動目的基因的高水平表達。但廠短在T7啓動子正下遊有一個lac操縱子（LacO）序列，它可以與lac阻遏舞站蛋白（LacI）蛋白作用以阻斷T7啓動子的轉錄。來書pET載體上攜帶有LacI的天然啓動子和編碼序列。LacI蛋白可以作用于宿唱數主細胞中的LacUV5啓動子，以抑制宿主劇市菌合成(chéng)T7 RNA聚合酶；也作用于pET載體上的T7la年那c啓動子，以阻斷抑制由于T7 RNA polymerase的湖就洩漏表達引起(qǐ)的目的基因的轉錄。IPTG可以阻斷LacI的抑制作學了用，從而誘導T7 RNA聚合酶和目的基因的表達。

盡管pET是高水平重組蛋白表達系統，但也可通過(guò)通厭減少IPTG的用量來調控降低表海他達水平，這(zhè)對(duì)于表達可溶性低的蛋白是非常有利的。玩房另外，當T7 RNA聚合酶不存在時(shí)，目的基因可以維持在轉錄沉默狀南腦态。

所有定制的pET載體都(dōu)會(huì)克隆場但在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大腸杆菌中（如Stbl場熱3），以最大程度地降低質粒的不穩定性。對(duì)東森于重組蛋白生産，我們推薦將(jiāng)載體轉移到BL21（DE3）或HM睡唱S174（DE3）宿主菌中，這(zhè)些菌株坐資的基因組攜帶了由LacUV5啓動子驅動的T7 RNA聚合酶基因。如果目的基因表如鄉達毒性蛋白，則建議使用攜帶pLysS或pLysE質粒的宿主菌，這(z問厭hè)些質粒通過(guò)産生T7溶菌酶（T7 RNA聚合酶抑制哥現劑）來抑制目的基因的本底表達。

優勢

表達水平高：T7轉錄和翻譯調控系統能(néng)使目長如的蛋白高水平表達。通常情況下，重組蛋白的表達量可達到總蛋白量的50弟樹％。

表達嚴謹：在沒(méi)有添加IPTG的情況下，目的基因的表達通常會(hu放行ì)被(bèi)強烈抑制。在大多數宿主菌株中，目的基因的這(zhè)種(還訊zhǒng)“關閉”狀态非常穩定，且适用于大部分基因。

不足之處

宿主要求：pET載體應保存在缺乏T7 RNA聚合酶基因的大腸杆菌中，須轉移至攜帶站如T7 RNA聚合酶基因的宿主菌中誘導目的蛋白黃她的表達。

潛在洩漏表達：在某些表達宿主菌株中，即使沒(méi)有IPTG，T7 RNA聚西弟合酶也會(huì)低水平表達，使得某些目的基因洩露表達從而引起煙計(qǐ)細菌毒性反應。

載體關鍵元件

T7 promoter: Drives high-level tr哥愛anscription of the 拍空gene of interest when T7 RNA polymera地書se is present. Whe西是n placed immedi員體ately upstream of a LacO elem日少ent, the entire cassette is些土 known as the T7lac promoter光白.

LacO: Binding site for 理你LacI. This element inhibits 醫討activity of the T7 promoter錯廠 when LacI prote議下in is present, preventin年那g leaky expression of the事厭 gene of interest.

RBS: The ribosome-binding site and t一裡ranslation initi好討ation element from T7 ba雪麗cteriophage. This allows for eff鐘子icient production 通明of the protein of inter去放est.

ORF: The open reading frame of your gene 用一of interest is place年些d here.

T7 terminator: Signal sequence to terminate the東雪 transcript made from the gene歌火 of interest, preventing ru筆暗n-on transcription.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allo吃術ws the plasmid to be ma外中intained by ampic遠雨illin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids 嗎一carrying this origin 木輛as well as the Rop gene exist in low co術快py numbers in E. coli.

Rop: Repressor of primer. I能畫t encodes a small protein t去西hat regulates plasmid cop個慢y number. The presence 資志of the Rop protein,愛木 in combination of pBR322 origin o店小f replication on the pl雨答asmid, results in嗎東 low copy numbers of the plasm內妹id.

LacI: The E. coli natural promoter and coding街哥 sequence for the la慢看c repressor. In the absence of induc近還tion of the system (i.e. witho地姐ut IPTG), the LacI pro去費tein represses transcription of the gen那場e of interest from th做高e T7lac promoter, 一文as well as transcription o少現f T7 RNA polymerase from the LacUV5 pr都得omoter in host strains used for recomb黃我inant protein production.

相關服務

細菌蛋白表達載體pET