線蟲gRNA表達載體

概述

CRISPR/Cas9（成(chéng)簇規則間隔短回文重複序樹物列/CRISPR相關蛋白9）系統極大地促進(jìn)了多種(zhǒn問煙g)物種(zhǒng)的體外和體内基因抑制實驗。在細胞内，Cas9核酸酶與引腦東導RNA（gRNA）形成(chéng)複合物，該複合物通分工過(guò)與基因組中的18-2火謝2 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向(x答男iàng)特異性。gRNA與靶位點通過(guò)互補配對(duì)使Cas9男一定位到靶序列上，然後(hòu)切割基志土因組中的靶位點。Cas9掃描基因組并切割與gRNA互了購補的序列，前提是這(zhè)些序列跟随著(zhe)一段NGG前間區序列鄰身就近基序（PAM）。雙鏈DNA斷裂随後(hòu)被(bèi)H南商DR或者NHEJ途徑修複，從而産生不同大小長(cháng)度的司朋位點突變（堿基插入或缺失）。

使用一個一體化的同時(shí)表達Cas9和gRNA的匠答載體，或者分開(kāi)表達Cas9和綠好gRNA的載體，可以方便地在線蟲中進(jìn)行CRISP低到R/Cas9編輯。該載體系統屬于後(hòu)者，現章包含一個線蟲密碼子優化的U6啓動子麗物驅動表達的gRNA。該載體可以被(bèi)注射到線蟲的遠林線端性腺，然後(hòu)進(jìn)入生殖細胞細胞核。使體廠用該載體注射的線蟲可以表達Cas9。篩選突變件少後(hòu)代，獲得突變可遺傳的基有西因敲除線蟲品系。

關于該載體系統的更新信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Genetics. 202:885 (2016)河厭	DNA transformation in C. 兒制elegans
Curr Protoc Mol Biol. 129 (20熱朋19)	CRISPR/Cas9 vectors in C. ele鄉輛gans
Nat Methods. 10:741 (章少2013)	gRNA design for C. elegans

亮點

通過(guò)在載體骨架上整合進(jìn)人工合成(chéng)的啓動要小子近側内含子序列，我們的載體經(jīn暗妹g)過(guò)優化可以在線蟲中票們高效表達轉基因。

優勢

技術簡單：使用顯微注射即可把質粒轉入細胞，相比起(qǐ)病毒載體需要進(jìn)行病毒包短數裝，過(guò)程更簡單。.

靈活性：根據使用者的實驗需求，我們的線蟲gRNA表達載體可們物以搭配不同類型的Cas9使用。

不足之處

基因拷貝數在不同細胞中呈現差異性：盡管成(chéng)功的轉染可以在單個細胞裡(lǐ)産生黑農非常高的拷貝數，但不同細胞間卻有高度的差異性。在一些細胞中，質粒拷貝數說短非常高，而在另外一些細胞卻是低拷貝甚亮山至沒(méi)有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位點必須包含NGG序列（使用較多了場），也叫(jiào)做PAM序列，位于gR多民NA識别序列3'末端。

關鍵元件

CeU6: C. elegans U6 small nuclear RNA pr懂照omoter. It drives st湖票rong expression levels船報 of small RNAs.

gRNA: Guide RNA compatible with the Cas9 光討variant being used.

Terminator: Pol lll transcription termin黃海ator. It allows transcription 市遠termination of sma廠暗ll RNA transcribed by 喝作Pol lll RNA polymerase.

Ampicillin: Ampicillin resi白內stance gene. It all這黃ows the plasmid to be maintaine下友d by ampicillin selection in E. coli慢物.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids ca學個rrying this origin exi討歌st in high copy number費拿s in E. coli.

相關服務

線蟲gRNA表達載體