哺乳動物基因普通表達腺相關病毒載體

概述

腺相關病毒（AAV）載體系統是一種(zhǒ你花ng)備受歡迎的體内外基因傳遞系統，中頻對(duì)哺乳動物多種(zhǒn關有g)類型細胞具有高效的轉導效率。不同于腺病毒，AAV的免疫原性極腦門低，在體内幾乎沒(méi)有緻病性，使得AAV成(ch年遠éng)爲許多動物研究的理想工具。

AAV重組載體構建完成(chéng)後(hòu)與輔助質老也粒一起(qǐ)轉染進(jìn)入包裝森讀細胞。在包裝細胞中，位于兩(liǎng)個反人信向(xiàng)重複序列（ITRs）之間的D司那NA片段與輔助質粒表達的病毒蛋白進(jìn)一步包裝成(ché窗朋ng)病毒顆粒。

當病毒轉導宿主細胞時(shí)，兩(liǎng)個ITR之間的樂會外源DNA及病毒基因組一起(qǐ)進(費司jìn)入細胞，線性雙鏈DNA基因組以遊離DNA的放東形式存在于細胞核中。

在大多數情況下，可以在生物安全1級（影北BSL1）設施中處理AAV。AAV是複制缺陷型的、不會(h問著uì)引起(qǐ)炎症反應和引發民厭(fā)人類疾病。

人們已從自然界中鑒定出許多AAV病毒株，根據病毒表面(miàn樂子)衣殼蛋白的不同抗原將(jiāng)它們分成(ch行她éng)不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的組織嗜性（即感染組織特異性）。花音當我們的AAV載體使用不同的衣殼蛋白包裝病毒時(shí)，則雨信會(huì)賦予病毒不同的血清型。AAV包從都裝時(shí)的ITR序列來源于AAV2，這(zhè)是一種(zhǒng)關到常用的AAV載體構建方式，不影響血清型。另一方面(miàn)，決定血清現笑型的衣殼蛋白基因由Rep/Cap包裝質粒編碼。聽音下表列出了不同的AAV血清型及對(duì)應的組織嗜性。

以血清型分類以組織嗜性分類

血清型	組織嗜性
AAV1	Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver
AAV2	Smooth muscle, CNS, brain, liver, pancreas, kidney, retina, inner ear, testes
AAV3	Smooth muscle, liver, lung
AAV4	CNS, retina, lung, kidney, heart
AAV5	Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, heart
AAV6	Smooth muscle, heart, lung, pancreas, adipose, liver
AAV6.2	Lung, liver, inner ear
AAV7	Smooth muscle, retina, CNS, brain, liver
AAV8	Smooth muscle, CNS, brain, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9	Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney, adipose
AAV-rh10	Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ	Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8	Liver, brain, spleen, kidney
AAV-PHP.eB	CNS
AAV-PHP.S	PNS
AAV2-retro	Spinal nerves
AAV2-QuadYF	Endothelial cell, retina
AAV2.7m8	Retina, inner ear

組織嗜性	推薦AAV血清型
Smooth muscle	AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10
CNS	AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP.eB
PNS	AAV-PHP.S
Brain	AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
Retina	AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8
Inner ear	AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
Lung	AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAV-rh10
Liver	AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Pancreas	AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10
Heart	AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ
Kidney	AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Adipose	AAV6, AAV8, AAV9
Testes	AAV2, AAV9
Spleen	AAV-DJ, AAV-DJ/8
Spinal nerves	AAV2-retro
Endothelial cells	AAV2-QuadYF

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻。

參考文獻	主題
Methods in Enzy. 507:229-54 (20紅習12)	Review of AAV virology and uses
Curr Opin Pharmacol. 24:59-67 (2秒制015)	AAV use in gene therapy, and睡笑 serotype differences

亮點

我們的AAV載體是經(jīng)過(g師老uò)優化的，可在大腸杆菌中進(jìn)行高拷貝複制，是樹信一個包裝病毒滴度高，細胞轉導效率高，轉基因高水平表達的載體系統。該載這地體可用所有已知衣殼蛋白血清型的輔助質粒進(jìn)行南音包裝，包裝出來的病毒具有非常高的轉導效率，知鐘且具有極高的生物安全性。

優勢

安全性：AAV是可供選擇的最安全的病毒載體，它是事一複制缺陷的，不會(huì)引起(qǐ)任何人類疾用家病。

對(duì)宿主基因組造成(chéng)破壞的低風險性身裡：在轉導進(jìn)入靶細胞後(hòu科在)，AAV病毒載體在細胞核保持著(zhe)術務遊離DNA的狀态，可以降低宿主基因組被(bèi)破技妹壞而緻癌的風險，使其成(chéng)爲人類體内實驗的高的理想載體。

高病毒滴度：利用我們的AAV病毒載體可以包裝成(chéng)高滴度的病毒。我們錢海提供的病毒包裝服務病毒滴度可達到>10¹³ GC/ml。

宿主範圍廣：針對(duì)不同來源的常用哺乳動物（如人、小鼠和人不大鼠）細胞和組織，將(jiāng)我們的AA區服V載體包裝成(chéng)對(duì)其具錯玩有親和性的血清型，可輕易實現高效轉導。但是，某些類型的細胞仍然難以轉導高些（見下文不足之處），這(zhè)與所用的血清型有喝懂關。

體内外實驗均有效：我們的載體不僅能(néng)用于體内活體動物實驗，還(hái)具有體外細胞轉費可導能(néng)力。

不足之處

載體容量小：AAV是我們所有病毒載體系統中裝載量最小的。A輛路AV的兩(liǎng)個ITR之間所能(néng)容納的市我最大序列長(cháng)度是4.7 kb，允許使用者插入雨錯~4.2 kb的目的序列。

難以轉導特定類型的細胞：當利用合适的血清型進(jìn)行包裝時(shí)，我們的AAV載體相用系統可以轉導很多不同類型的細胞，包括非分裂細胞。不同AAV血清型對(duì)不村器同類型的細胞具有不同的嗜性，針對(du關文ì)某種(zhǒng)特定類型的細胞需要特定血清型。

技術複雜：使用AAV病毒載體時(shí)，需要在包裝細胞中産生活病毒，下雨然後(hòu)測定病毒滴度。這(zhè)些過(guò)程相對(duì)于常子刀規質粒轉染，技術難度更高，周期更長(cháng)。在姐山訂購載體的同時(shí)，可以通過(guò)訂購我們的病毒包服從裝服務輕松解決這(zhè)些問題。

載體關鍵元件

5' ITR: 5' inverted terminal 刀見repeat. In wild type virus, 5' IT和地R and 3' ITR are essentially i技作dentical in sequence. They resi體道de on two ends 身拍of the viral genome pointing i視但n opposite directions廠水, where they serve as the農習 origin of viral genome replic就為ation.

Promoter: The promoter that drives your gene of 聽明interest is placed h知煙ere.

Kozak: Kozak consensus sequence. I動校t is placed in front of the start codon媽遠 of the ORF of intere很坐st to facilitate translati土車on initiation in eukaryotes.

ORF: The open readin樹服g frame of your gene of inte懂頻rest is placed here.

Regulatory element有看: Allows the user to add the Woo站時dchuck hepatitis virus posttranscr機筆iptional regulatory 些嗎element (WPRE). WPRE enhances v著站irus stability in packaging cells, lead歌樹ing to higher titer 那科of packaged virus; 吧西enhances higher e南微xpression of transg如明enes.

BGH pA: Bovine growth hormone pol上喝yadenylation. It facilitates 慢吃transcriptional得車 termination of the up呢著stream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. S兵為ee description for 5’ ITR.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene.物廠 It allows the plasmid to b從舊e maintained by ampi拿樂cillin selection 科聽in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replicatio得拍n. Plasmids carrying t木頻his origin exist in high copy number睡睡s in E. coli.

Representative vector 畫船design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9394npt	pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE	A single-stranded AAV (ssAAV) mam個老malian gene expression vector en地房coding CMV-driven EGFP with a WPRE reg算器ulatory element.
VB231214-1622uat	pAAV[Exp]-CAG>hSMN1[制子NM_000344.4]:WPRE	A single-stranded AAV (s路煙sAAV) vector expressing a human國商 survival motor neuron gene SMN1, whi校大ch is associated with SMA鄉線, driven by a CAG promoter with 好多the regulatory element WPRE.

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