哺乳動物Cas9表達PiggyBac載體

CRISPR/Cas9（規律成(chéng)簇的間隔短回文重複序列及相關蛋近通白9）核酸酶表達載體屬于幾種(zhǒng)新興的基因組編輯工具之雨服一（另外兩(liǎng)種(zhǒ坐通ng)是ZFN和TALEN），可在基因組的靶位器低點快速有效地産生突變。這(zhè)些質粒上舞載體編碼的特異性RNA，能(néng)短河夠引導DNA核酸酶（或缺刻酶）編輯基因組中特定位點的DNA序列快機。

Cas9是RNA引導DNA核酸酶，是天然原核免疫系統店城的一部分，賦予細菌産生對(duì)質粒和噬菌體黃的等外源遺傳物質的抵抗能(néng)力。在細胞内，Cas9核酸酶與引公錯導RNA（gRNA）形成(chéng)複合物，該複合物通過(guò)動服與基因組中的18-22nt的同源靶序列直接相到海互作用，gRNA與靶位點通過(guò)互補配對(duì)使Cas9定位到靶序低師列上，然後(hòu)切割基因組中的靶位點。劇我

使用CRISPR打靶目的基因需要目标細胞同時(shí)表達Cas9和特異河河gRNA。這(zhè)可以通過(guò)在同一個載體上共表達Ca理票s9和gRNA，也可以通過(guò)在兩(liǎng)個載體各上自表達Cas9照業和gRNA來實現。使用Cas9和gRNA兩物他(liǎng)個載體分開(kāi)表達的優勢在于可使用不同的gRN小去A與不同的Cas9變體組合（如野生型Cas9，Cas9n，dCas公雨9），從而根據實驗目的帶來更多變的實驗方外木案。此外，使用單獨的Cas9表達載體還(hái)可舊子以構建穩轉細胞株，獲得比質粒瞬轉更均一和高水平的C雨是as9蛋白表達。

我們的Cas9表達piggyBac載體是將(jiāng)Cas9基因永久導東他入一系列類型的哺乳細胞的有效而又簡便的工具。基這大于PiggyBac轉座子系統的轉導方式可以利用質粒轉染而非音相病毒轉導的方法就(jiù)能(néng)將(jiāng)Cas醫頻9表達框永久整合宿主基因組。PiggyBac系統包含兩(liǎng化購)個載體，一個載體被(bèi)稱爲輔助質粒，負責編碼轉座看男酶；另一個載體被(bèi)稱爲轉座子質粒，包含兩(liǎ火樹ng)個末端重複序列（ITR）以及兩(又外liǎng)者之間的被(bèi)事喝轉座區域，需要被(bèi)轉座到宿主基因組中的Ca雨化s9表達框就(jiù)克隆在這(zhè)個能員區域。

當輔助質粒和轉座子質粒共轉染靶細胞時通廠(shí)，輔助質粒産生的轉座酶將(jiāng)會(huì)識别轉座子的兩問都(liǎng)個ITR元件，然後(hòu)將(jiāng)被跳林(bèi)轉座區和兩(liǎng)個兵工ITR元件插入到宿主基因組中。PiggyBac屬于II類哥匠轉座子，通過(guò)“剪切—粘貼森吃”的機制移動，從一個地方轉座到另一個地方，而不留下序列本身街友（恰好(hǎo)相反，I類轉座子是通過(guò)“複制—粘貼”的方還制式移動）。由于輔助質粒是通過(guò)瞬時黃訊(shí)轉染進(jìn)入宿主細胞資男的，故會(huì)逐漸丢失。随著(zhe)輔助質匠是粒的丢失，轉座子在宿主基因組中變成(ch理那éng)了永久整合。當這(zhè)些宿主細胞再次被(bèi湖舞)輔助質粒轉染，整合的轉座子會(huì)再次通過(guò)“剪切長志—粘貼”的機制移動。

我們提供多種(zhǒng)版本的來源于Streptococcus pyogen他土es的SpCas9。這(zhè)其中包括hCas9，人源化的野生型Sp廠購Cas9，能(néng)有效地在靶序列制造DNA雙鏈斷裂（DSB）；hCas9算說-DA10，核酸酶突變型的人源hCas9，隻對(duì)靶序列的DNA單鏈器錢造成(chéng)切口；dCas9，bao'ha門錯nD10A和H840A突變，屬于無核酸酶活性的SpCas9；路計SpCas9-HF1，親和性強化的SpCas9；以及e微照SpCas9，特異性強化的SpCas9。dCas9融合轉錄激活結構她器域如dCas9/VP64和dCas9/VPR下學，或者融合轉錄抑制結構域後(hòu)，如dCas9/KR技火AB，可分别應用于CRISPRa和CRISPRi系統。此外，我們提供的來樂長源于Staphylococcus a歌很ureus的SaCas9，其序電鄉列要比SpCas9和來源于Acidaminoco鐘新ccus的AsCpf1更短（As海答Cpf1屬于新一代CRISPR基因編輯系統。AsCpf1造成(ché信筆ng)DSB時(shí)，兩(liǎng)條DNA鏈上的切口位雨火置相互錯開(kāi)，形成(c冷公héng)粘性末端）。

關于該載體系統的更多信息，請參考以下文獻做讀。