爲什麼(me)我的熒光蛋白這(zhè)弟電麼(me)弱？

低到中等程度的抗性基因表達就(jiù)能銀間(néng)讓細胞獲得對(duì)什們藥物的抗性。相反，熒光蛋白（FP）則需要高水平的表達才能(néng)獲得明亮的店高熒光信号，較低或者中等程度的熒光表達會(huì)産生較弱說北的熒光信号，甚至會(huì)低于設備檢測的最低臨界值。此外，某些熒光蛋白（車黑如EBFP）比常用熒光蛋白（如EGFP）更暗淡，特别難以檢測。一些研究人員不得我視不使用抗熒光蛋白抗體，以可視化體外細胞培養或體内的熒光蛋白。以下是導緻熒道從光不良的最常見原因：

弱啓動子驅動熒光蛋白的表達

有一些啓動子本身就(jiù)比較弱（如UBC），隻能(né但男ng)驅動熒光蛋白的弱表達。有的啓動子（如CMV）可以在多音體外細胞培養中很好(hǎo)地起坐舊(qǐ)作用，但有時(shí)在體内習短會(huì)沉默。當表達熒光蛋白時(shí)，您應該盡可能(近機néng)嘗試使用一個強的廣泛性啓動子（如EF1A或CAG）。如果您必師光須使用組織特異性啓動子，請盡可能(雪些néng)選擇一個表達能(néng)力強的；如果您購行必須使用弱或很弱的啓動子，請爲熒光蛋白信号不足的可能(né票錯ng)性做好(hǎo)準備。當這(zhè)種(zhǒng)情況發(fā)生讀暗時(shí)，這(zhè)并不意味著(zhe)您的熒光蛋白沒(méi)有表達，要公它可能(néng)隻是表達量不高。您可以使用更靈敏的檢測方法，如RT-雜校PCR或免疫熒光進(jìn)行檢測。

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在慢病毒和MMLV載體中表達熒光蛋白和黑

對(duì)于逆轉錄病毒載體系統（慢病毒或者MMLV），計房聚腺苷酸化信号（poly A）不能(néng)存在于LTR之間又銀，因爲這(zhè)會(huì)抑制病毒的包裝。林路多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中，來自上遊啓動子的轉議多錄會(huì)經(jīng)過(guò)上遊影學ORF的末尾繼續往下遊的啓動子和OR說城F轉錄，這(zhè)會(huì)導緻下遊ORF的線訊表達部分受到抑制。當下遊ORF爲熒光蛋近行白時(shí)，其表達會(huì長服)大大減少。您可以采取如下措施提高熒光蛋白的表達：

使用不同的載體系統，比如使用常規載體，腺病毒載體或腺相錯少關病毒載體
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使用熒光更強的熒光蛋白變體（如TurboGFP代替靜和EGFP）
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如果考慮在多順反子的上遊表達盒表達熒光蛋白，您可以使用說麗2A linker連接目的基因和熒光蛋白基因。體南然而，這(zhè)可能(néng)會(huì)影響多順反子中其他ORF的說內生物學(xué)功能(néng)，也可能(néng)導緻熒光蛋白錯照表達較弱（見下文），且會(huì)增加載體構建的成(ché紙好ng)本和時(shí)間。
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在多順反子中表達熒光蛋白

當在多順反子中表達熒光蛋白基因時姐老(shí)，通常會(huì)存睡個在以下所述問題，且有時(shí)就音熒光蛋白基因的表達與上遊下遊ORF有關。

熒光蛋白基因在IRES的下遊
在包含一個或多個IRES元件的多順反子中，與上遊ORF相比，下遊ORF表呢請達水平比較低（通常爲上遊的10%-20費拍%）。如果一個熒光蛋白在IRES金分的下遊表達，則熒光會(huì)較弱。如果您必須在多順反子的下遊表達熒光蛋煙睡白，您可以考慮使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通過樂又(guò)使用2A肽，多順反子下遊ORF通常與上遊ORF的表達錢是量相當（或稍微低一點）。然而，2A肽也有缺陷，低兒如可能(néng)會(huì)影響靶基因（GOI）的功能(néng)。當我黃存在多個2A肽時(shí)，下遊ORF傾向(錯女xiàng)于以較低水平表達。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效工鐵率會(huì)受上下遊ORF序列的影響。因此，不能(néng)市書進(jìn)行有效自我切割的融合蛋白將(jiāng)會(huì)是一種(空下zhǒng)翻譯産物，在某些實驗運用中，這(zhè)是的還一個值得注意的問題。需要特别注意的是2A肽的切割會(huì技的)在上遊蛋白的C末端留下額外的短肽，并在下遊蛋白的N末端留下額外的脯妹地氨酸。在大多數實驗應用中，這(zhè)種(zh對朋ǒng)情況不會(huì)産生不良影響，一就但是在某些情況下可能(néng)會(huì)歌劇影響蛋白功能(néng)。
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熒光蛋白是融合蛋白的一部分
融合蛋白幾乎總是表現出比未融合蛋白較弱的熒光（比如EGFP/Neo融合蛋白的熒章電光比單獨的EGFP熒光更弱）。此外，未經(jīng)測相服試的融合蛋白可能(néng)存在胞内不穩定，錯誤折疊或無功能(néng)等問題錯白。如果您懷疑這(zhè)些是熒光弱的原因，可以嘗試以下操作：