雲舟生物是如何測定病毒滴度的？

收取病毒顆粒後(hòu)，如果病毒載體攜帶熒還動光報告基因，我們通常首先將(jiān睡體g)病毒轉導一些常見的細胞系（如H舊草EK293細胞），觀察熒光蛋白的表達來檢測病毒的質量。然後(hòu)，根據愛照不同的病毒類型使用不同的方法來定量測定月女病毒滴度。有時(shí)如果熒光觀察和定量測定的結果存在較大差異，我們將(j刀南iāng)重新測定或額外進(jìn)行驗證，以确保我子電們包裝的病毒是高質量的。

慢病毒

我們使用p24 ELISA法測定慢病毒滴度。該方法的三明治免疫試驗可測定北體HIV-1 核心蛋白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我們首先在微費窗量滴定闆上加入慢病毒樣(yàng)本，然後(hòu)每孔加入HI技制V-1 p24捕獲抗體進(jìn近空)行孵育，并随後(hòu)添加生物素化的p24二抗以結合p24一抗。此後(對知hòu)，樣(yàng)本中加入的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）标記的有會鏈黴親和素可特異性結合生物素化高子的p24二抗。在最後(hòu)一步中，加入辣作畫根過(guò)氧化物酶底物反應液，經(jīn對吧g)HRP催化産生有顔色的産物。每高熱個孔的顔色深度最終反映了慢病毒樣(y土計àng)本中的p24含量。使用分光光度計測量北雪的樣(yàng)本吸光度數值與亮通重組HIV-1的 p24标準曲線進(jìn)行對(duì)照，然我務後(hòu)被(bèi)換算爲對(duì)應的慢病毒滴度。

腺病毒

對(duì)于腺病毒，我們同樣(yàng)會(huì)測內林定功能(néng)滴度。將(jiā都理ng)經(jīng)過(guò)一系列稀釋的腺病睡短毒轉導HEK293細胞後(hòu)，我們使用一種(zhǒng)基于免疫票理細胞化學(xué)的方法，通過(guò)檢測腺病毒特異性六鄰體蛋白來計算出被(了去bèi)成(chéng)功轉導的細胞，每一個被(bèi)免疫組化染色的細胞被(城空bèi)視爲一個轉染單元。以非常低的感染複數（MOI）感染細胞，以确保大多看從數被(bèi)轉導的細胞被(bèi)單個病毒顆粒從快感染。該測定方法與常規空斑測定具有良好(hǎo)的相關性。對(duì)于得得超純化腺病毒，我們直接測量病毒顆粒的光密度（使用OD₂₆₀）來預估病毒的滴度，因爲超純化腺病毒的光密度綠個與功能(néng)性滴度之間存在緊密相關性。腺爸信病毒具有非常高的穩定性，可以在室溫下放置數天還(hái)能(néng)保通得持功能(néng)活性。

腺相關病毒（AAV）

我們通過(guò)直接從裂解的病高頻毒顆粒中提取病毒基因組來測定AAV的滴度，使用qPCR來精确定量病毒基因動如組的拷貝數（使用ITR區域的拷貝數作爲朋也參照）。腺相關病毒顆粒是非常穩定的，可以在室購靜溫下放置數天還(hái)能(néng)保持功能術雨(néng)活性。因此，腺相關病毒的滴路場度盡管不是以細胞轉導的方式測定，但是也非不計常接近其實際功能(néng)滴度。

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