相比CRISPR和TALEN基因敲除技術，shRNA人到介導的RNA幹擾有什麼(me)優缺點？

shRNA幹擾或者核酸酶介導的基因敲除（如CR民現ISPR、TALEN）都(dōu)是在細胞水平上，研究基國裡因缺失對(duì)功能(néng)影響的重要實驗方法相這。爲了确定哪一種(zhǒng)方法對(duì)您的應用是最分風優選擇，需要考慮以下幾個方面(miàn)。

作用機制

• 幹擾載體

  幹擾載體通過(guò)表達短發(fā)夾RNA（shR去相NAs）來誘導細胞内目标mRNA的切割，抑制懂的其翻譯，從而達到在細胞水平抑制靶mRNA的功能(néng)。因此，shR動白NA幹擾載體不會(huì)引起學街(qǐ)靶基因DNA序列的變化。

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• 基因敲除載體

  CPISPR和TALEN都(dōu)是通笑草過(guò)引導核酸酶切割基因組的特要黑定靶位點來起(qǐ)作用，切口被(bèi)細胞機制低東少效修複，導緻永久性突變，如在修拍熱複位點插入或者缺失幾個堿基。某些突變會(huì)産生移碼，終止密風雜碼子提前出現等，從而導緻目的基因功能(néng)缺失風事。如果基因組中兩(liǎng)個臨近的位點（如小于幾kb）同時(shí)作林鐘爲靶向(xiàng)位點，可能(néng藍近)會(huì)導緻中間區域片段的缺失（即片段敲除）。見時

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靶向(xiàng)效率

shRNA介導的幹擾不會(huì)完全抑制靶基因的歌章表達，即使是最有效的shRNAs。相比之下，CRISPR老樂和TALEN可以在某些細胞産生永久的突變從而導緻基因功能(n很現éng)的完全喪失。

一緻性和均一性

在不同的轉染細胞間，shRNA幹輛放擾載體能(néng)夠産生較高的均一性和一緻如年性。相反，CRISPR和TALEN技紙刀術由于插入突變的随機性，細胞之間是高度不均一的。爲了完全敲時她除靶基因，該基因的所有拷貝都(dōu)必報唱須被(bèi)敲除。假設正常細藍算胞的基因都(dōu)具有兩(liǎng)個拷貝（除了X-或Y-連呢師鎖基因），而癌細胞可以有多個拷貝，這(zhè)種(zhǒng)完全敲除細胞的用報占比是非常少的。因此，核酸酶介導的敲除需身道要通過(guò)測序篩選以确認靶基線內因的所有拷貝已經(jīng)被(bèi)敲除。

脫靶效應

shRNA介導的幹擾與核酸酶介導的基因敲除都(dōu)具有窗秒脫靶效應。脫靶表型可以通過(guò)使用多種(zhǒ上她ng)不同的shRNA靶向(xiàng)相報慢同的目的基因來驗證。如果同一個基因使用多個不靜行同的shRNA幹擾導緻表型變化一南都緻，那麼(me)說(shuō)明表型改變不是由脫靶效應引近冷起(qǐ)。而對(duì)于C熱木RISPR或TALEN基因敲除，應當分析多個可影含有功能(néng)缺失突變的克隆，以排除由于脫靶效短在應導緻的表型改變。此外，可以對裡子(duì)生物信息學(xué)預測的脫靶位點進(jìn)行測序以确認是請東否發(fā)生突變

在線設計同源重組Donor載體