我應該選擇單gRNA還(hái)是雙gRNA用農民于CRISPR介導的基因敲除？

對(duì)于CRISPR介導的基因組編輯，Cas9新劇核酸酶靶向(xiàng)位點特異性引導R店短NA（gRNA）的靶位點以産生DNA切割。在大市兵多數情況下，爲了産生簡單的基因敲除，可以將(jiāng)單路的個gRNA與Cas9一起(qǐ)使用以産生雙鏈跳大斷裂（DSB），并通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）低效修複，導緻永長船久突變 ，如在修複位點産生小插入或缺失。某些突變會(我你huì)産生移碼，終止密碼子提前出爸裡現等，從而導緻目的基因功能(néng)缺失。如果基因組中兩(li舊文ǎng)個臨近的位點（如小于幾kb）同時(shí)作林事爲靶向(xiàng)位點，使用雙gRNA可能(néng)會(木一huì)導緻中間區域片段的缺失（即片段敲除）。

如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向吃書(xiàng)單個靶位點的兩(liǎng個呢)條相對(duì)鏈，則可以使用雙gRNA。缺刻酶將(jiāng)在兩(li靜跳ǎng)條鏈上産生單鏈切割，兩(聽日liǎng)條gRNA分别引導微請缺刻酶在對(duì)應的一條鏈上進(jìn)行切割，從而引起(qǐ唱去)靶位點處發(fā)生DSB。 通常情況下，這(zhè)種(zhǒng)方法可微技以減少CRISPR/Cas9的脫靶效應，因爲需要笑這兩(liǎng)個gRNA同時(shí)打靶才能(nén西冷g)産生DSB。

當使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模闆將(jiān可吃g)特定堿基（例如敲入）引入目的和朋基因時(shí)，也可以使用雙gRNA筆亮。兩(liǎng)個gRNA靶向(xiàng)位于所需突變位點側翼的兩(也暗liǎng)條相對(duì)鏈，然後(hòu房歌)通過(guò)同源定向(xiàng)修複（HDR）的方法利用外源模闆來修複鐵通被(bèi)切除的序列。

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