服務商工作站 >>
常見問題
藥物篩選标記 熒光蛋白 基因組編輯 蛋白表達 shRNA 病毒包裝 其他
爲什麼(me)我的藥物篩選标記不能(néng)讓細胞産生抗性？
藥物篩選基因通常隻需要低至中等程度的表達即可有效，但也有例外。以下是細胞無員問抗藥性的最常見原因：
使用的抗生素劑量過(guò)高
藥物反應因細胞不同而異。在使用抗生素討鄉之前，建議您對(duì)細胞制作一個緻死曲線（也稱“劑量反應曲線”），子但摸索出能(néng)有效殺死未轉染或轉導細胞的最討內低藥物濃度。即使細胞有抗藥性基因，但過(gu但城ò)高的藥物劑量也會(huì)導緻細胞死亡，且還(區海hái)可能(néng)危害細胞的生長(cháng)狀态。某些細胞對(朋懂duì)某些藥物極其敏感，這(z慢媽hè)時(shí)您可能(néng)需要考農長慮更換另一種(zhǒng)藥物篩選标記。
弱啓動子驅動藥物篩選基因的表達
有一些啓動子本身就(jiù)比較弱（如UBC）這醫，隻能(néng)驅動藥物篩選基因的弱表達，您有草可以考慮使用一個強的廣泛性啓動子（如EF1A地銀）。
在慢病毒和MMLV載體中表達藥物篩選基因
對(duì)于逆轉錄病毒載體系統（慢病毒或章師者MMLV），聚腺苷酸化信号（poly A）不能(néng身是)存在于LTR之間，因爲這(zhè)會(huì)抑制病毒的包裝。多聚腺苷酸化信遠你号存在于3'LTR中，來自上遊啓動子的轉笑老錄會(huì)經(jīng)過(guò)上遊ORF的末尾繼續電讀往下遊的啓動子和ORF轉錄，這(zh身房è)會(huì)導緻下遊ORF的表達部分受到抑制。當下遊ORF爲藥物路讀篩選基因時(shí)，其表達會(h筆讀uì)大大減少。您可以采取如下措施提高熒光蛋白的表達：
使用不同的載體系統，比如使用常規司哥載體，腺病毒載體或腺相關病毒載體
如果考慮在多順反子的上遊表達盒表達藥物篩選基因，您可以使用2A l相暗inker連接目的基因和藥物篩選基因。然而，這(zhè)可能(作商néng)會(huì)影響多順反子中其他ORF的生物學(xué)東放功能(néng)，也可能(néng)導緻藥物篩選基因表達較弱，且會(都生huì)增加載體構建的成(chéng)本和時(shí)間。
藥物篩選基因在IRES的下遊
在包含一個或多個IRES元件的多順要木反子中，與上遊ORF相比，下遊ORF表達水平月暗比較低（通常爲上遊的10%-2雪雨0%）。如果藥物篩選基因在IRES的下遊表達，則表達量會公他(huì)較低。如果您必須在多信嗎順反子的下遊表達藥物篩選基因，您可以考慮使用2A肽（如P2A或T2A），而明吧不是IRES。通過(guò)使用2A肽，多順反子下遊ORF通報懂常與上遊ORF的表達量相當（或稍微低一點）。然而，2頻們A肽也有缺陷，如可能(néng吧話)會(huì)影響靶基因（GOI）的功能(néng)訊電。當存在多個2A肽時(shí)，下遊ORF傾向(xiàng)于以較低水平表達。玩市另外，2A肽的自我切割并不是10家森0％有效的，其效率會(huì)受器銀上下遊ORF序列的影響。需要特看都别注意的是2A肽的切割會(huì)在上遊蛋白信月的C末端留下額外的短肽，并在下遊蛋白的N末端留下額外的海見脯氨酸。在大多數實驗應用中，這(zhè)種(zhǒng)情況不會(hu子老ì)産生不良影響，但是在某些情況下可能(néng)會(huì)影響蛋白功城河能(néng)。