我應該使用CRISPR還(hái)是TALEN技愛廠術進(jìn)行基因組編輯？

CRISPR和TALEN技術都(dōu)已成(chéng)功應用于體空熱外細胞培養和模式動物，兩(liǎng)者都(dōu)可以用來進(jìn)行基因問弟敲除、點突變或者片段敲入，但方法各異且各有優缺點。

作用機制

• CRISPR

  CRISPR系統利用位點特異性資電的引導RNA（gRNA）使Cas9核酸酶靶向(xiàng公生)切割基因組DNA形成(chéng)雙鏈裡子斷裂。靶向(xiàng)序列長(cháng)度哥請通常約爲20 bp，即便是含有幾個錯配堿基也可以被(bèi)呢看識别和切割。

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• TALEN

  TALEN系統使用一對(duì)嵌合蛋白，每個嵌合蛋白由FokI核酸酶結構音中域和TAL DNA結合結構域（識别特異性序列）大關組成(chéng)。這(zhè)對麗議(duì)蛋白可以結合基因組中的一對(duì)靶位點，每對(duì)約18 水雨bp，中間間隔區爲14-20 bp。一旦結合DNA，這(zh鐵到è)對(duì)蛋白上的Fokl核酸酶結構域可以形成(c樹們héng)二聚體，繼而導緻在兩(liǎn舞雜g)個靶位點之間的間隔區内産生DNA切割。

靶向(xiàng)效率

CRISPR和TALEN介導的基時靜因組編輯技術都(dōu)具有良好(hǎ中訊o)的效率，但是效率會(huì)因應高老用類型、物種(zhǒng)和細胞類型不同而異。一般而言，CRISPR我弟比TALEN能(néng)更有效地誘導DNA筆見切割。

脫靶效應

CRISPR gRNA靶向(xiàng)序列大約爲2鄉我0 bp，而TALEN對(duì)結合的靶序我從列總共約36 bp。此外，Cas9/gRAN複合物對(duì)序列明美錯配具有更高的耐受性（高達5 b也又p）。因此，TALEN介導的切割比C我綠RISPR具有更高的特異性，在基因組中産生脫靶切割朋白的可能(néng)性極低。相反，盡管CRISPR介導的敲除小鼠有較低的脫靶頻率微快，但是在細胞系中已經(jīng)日愛有關于CRISPR脫靶效應的報道(d黑數ào)。通過(guò)使用與雙gRNA配套的Ca熱老s9缺刻酶（Cas9突變體，僅含有一個催化核酸酶結構域，比件森如Cas9_D10A和Cas9_H8個低40A），可以在緊靠靶區域附近産生兩(li山風ǎng)個單鏈DNA缺刻，在靶區域内産生雙缺刻DS刀街B（雙鏈斷裂），這(zhè)些缺刻會(huì)被(bè雨爸i)重新修複。雙gRNA將(jiāng)靶序列擴展至約40 bp票們，從而使脫靶效應最小化。

靶點要求

基因組中幾乎所有序列都(dōu)可以作爲TALEN靶位點。相比之下，CR吧機ISPR靶位點的選擇受gRNA靶序列3'末端PAM序列（通常爲NGG）的拿山限制。對(duì)于基因敲除來說(shuō)，這(zhè)并不是障礙，我音因爲基因中會(huì)有多個潛在有效的靶位點。但是，在老生基因的特定位置産生特異性的突變或者城那插入則存在一定的影響。爲了使用CRISPR精确編輯基黃鐘因組中的特定位點，可以將(jiāng)同源重組Don間議or載體或含有預期編輯序列和同源信媽臂的長(cháng)寡核苷酸，與gRNA和Cas唱輛9一起(qǐ)轉運至細胞中，以便在靶位點處指作年導HDR（同源定向(xiàng)修複）介導的費家DNA修複。

在線設計同源重組Donor載體

簡易性

在簡易性方面(miàn)，與TALEN相比，CRISPR有幾個方面(miàn)綠看的優勢。首先，載體構建方面(miàn)，CRIS站資PR系統僅需構建短gRNA，因爲Cas9/跳都gRNA複合物的靶向(xiàng)依賴于簡單的RNA/D理麗NA雜交，而TALEN系統需要重新設計每個蛋白-DNA相互作民愛用獨特的TAL DNA結合結構域。TALEN每個靶知資位點總是需要兩(liǎng)個載體，因此，gR分分NA比TALENs更便宜且更容易設計男路和構建。不過(guò)，TALEN預制識别模塊（如VectorBuil男務der系統中内置的模塊）能(néng)夠大大減少構建TALEN習工載體的工作。其次，對(duì)于一些應用，如注射小鼠胚胎，Cas業相9蛋白和gRNA可以通過(guò)直接注射，但TALEN不能(néng)。明厭第三，CRISPR能(néng)夠廣泛應用于遺傳篩雜來選實驗，可以高通量地輕易構建數千種個得(zhǒng)不同的gRNA以形成(chéng)CRISPR篩選對身文庫。