爲什麼(me)我的shRNA對(duì)靶基因地小沒(méi)有起(qǐ)到幹擾作用？

并不是所有的shRNA都(dōu)會(huì)起(qǐ)作用

根據我們的經(jīng)驗和來自客戶的反饋，使用3-4個shRNA進(多影jìn)行幹擾測試時(shí)，通常隻有2-3個有比較合理的幹擾效果。所以麗靜，在使用shRNA時(shí)，器雜重要的是要認識到并非所有的shRN唱光A都(dōu)能(néng)正常工作。通常情況下，約50-70％的s又通hRNA具有幹擾效果，其中隻有約20-30％的s黃答hRNA具有比較明顯的效果。如果您使用幾個shRNA靶向(xiàn習匠g)同一個基因都(dōu)沒(méi)有一個舞理能(néng)産生滿意的幹擾效果，最好(hǎo)要為的解決方式是嘗試更多的shRNA，特别是那些經(jīng)過(guò)文了綠獻驗證的shRNA。目前，許多研究人員使用靶向(xiàng輛西)相同基因的shRNA庫（即不同shRNA的混合物）進(jìn)行實東間驗，以期提高幹擾效率。

幹擾效率檢測方法不當

最常用評估shRNA幹擾效率的靈敏測定方法是RT-qPC制事R，您可能(néng)需要嘗試幾對(duì)引物，篩選出最具特異性和效率的引金能物對(duì)。通常情況下，RT-qPCR引物應跨越内商煙含子，即設計在兩(liǎng)個外顯子上，以免擴增基因組DNA。通請當使用新引物時(shí)，建議您先進(jìn)行預擴增實驗，北女并將(jiāng)PCR産物進(jìn)行電泳算們檢測目的條帶，或者甚至可以通過(guò)測序驗證PCR産物路木是否正确。在進(jìn)行RT-qPCR的同時(s少相hí)，應注意設置minus-RT對(duì)照以評估基因組DNA的污染慢綠水平。您可以使用NCBI引物設計工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov白舞/tools/primer-blast/）來檢查引物質量。

幹擾效率也可以通過(guò)蛋白質印迹法（W視畫estern blot）進(jìn)行評估。然而，該方法常産生來自非特異畫街性抗體結合的假陽性條帶，從而導緻誤判沒(méi)有幹擾效果。因此，在著坐使用時(shí)需要确保抗體的特異性。

您使用的shRNA可能(néng)隻打靶基因的某個轉錄本

在設計shRNA時(shí)，我們推薦您使用那些能(nén訊答g)靶向(xiàng)單個基因多個轉錄本的shRNA，除非有得您隻想打靶特定轉錄本。VectorBuilder提供針術在對(duì)常見物種(zhǒng)的shRNA數據庫。當您將(jiāng)道也shRNA元件插入載體時(shí)，您可以選擇shRNA數據庫厭又，通過(guò)搜索目的基因查看所窗議有可用的shRNA詳細信息。您還(hái)可以打開(kāi)其中的UCS行拍C鏈接，查看shRNA序列在基因組和轉錄本中位置等信息。