載體構建

在分子生物學(xué)中，載體是一種(zhǒng)可以攜帶外源核酸序列進(j件人ìn)入靶細胞中的物質，有質粒DNA載體、人海計工染色體載體、病毒載體等多種(zh員又ǒng)形式。基因工程最常使用的載體是質粒DNA載體，通常現媽包含複制起(qǐ)點、啓動子、篩選标記等多種(zhǒng)載體線遠元件。構建質粒DNA載體的目的即是要將(jiā了南ng)外源DNA片段插入到質粒骨架上。該質計內粒可以在宿主菌中自我複制，并且在一地術些情形下進(jìn)一步用于下遊的細胞轉染或者病毒包裝等實驗，從而實現外視購源DNA在靶細胞中的表達。

傳統實驗室方法構建含有目的基因的重組質粒錢機DNA載體一般采用酶切連接法，其操作數風流程概括如下：

1、用一定量的DNA限制性内切酶切割質粒話得，使質粒出現缺口，切口處的黏性末端暴露；
2、再用DNA限制性内切酶處理目樂低的基因的DNA片段，使其産生對(duì)應的黏性末端開機；
3、將(jiāng)處理好(hǎo)目的基因片段以與切割好(hǎo)鄉她的質粒混合。目的基因片段的黏性末端和質粒切口的黏性末端互補配對(duì)；
4、再加入适量的DNA連接酶，催化目的基因片樂討段和質粒DNA鏈之間形成(chéng)磷酸二酯鍵畫動，從而將(jiāng)相鄰的脫氧核糖核酸連接起(qǐ)來，形成(ch章熱éng)一個重組質粒DNA分子。
5. 重組質粒DNA轉化大腸杆菌并擴增，然後(hòu)篩選轉化後(hòu)秒道的克隆并驗證目的基因的連接效果。

對(duì)比效率較低的酶切連接法，雲舟生物可使用多種(zhǒng)高通量長線策略進(jìn)行載體克隆。在我們的高度優化的克隆平台上，一般的表達載體從店我們使用Gateway克隆和Gibson組裝等方式構建，而sh黃風RNA和gRNA載體則使用基于直接連接雨藍的方式快速構建。此外，根據具體項目的需要，我們也可以使用從頭為姐基因合成(chéng)、Golden理亮 Gate等方式構建載體。