雲舟生物提供全方位的适用于體外和體内實驗的CRISPR基因編輯解決方讀睡案。我們的 CRISPR 産品女司涵蓋多種(zhǒng)預制或定制CRISPR載體（質粒、病毒和北我RNA）。我們的CRISPR系統可使用主流多種(zhǒng)工具病毒（下國慢病毒、AAV和腺病毒）進(jìn)行包裝以實現在難轉數他染細胞中的高效基因遞送，此外我們也專注于構建用于基因敲除、基因激活、基因煙吧抑制以及CRISPR篩選的高質量CRISPR文庫從房。經(jīng)過(guò)我們獨特設計的全基因組雙gRNA敲除文庫是用于人下如類和小鼠基因功能(néng)篩選的強大工具。
亮點
定制CRISPR載體
CRISPR介導的基因編輯需要靶細胞爸路共表達Cas9和特異性gRNA。使用我們大得高度直觀的線上載體設計平台，您可以選擇超過(guò)30種海和(zhǒng)載體骨架（非病毒的、病毒的照地或轉座子類型的載體）以及并可通過(gu門間ò)随意組合載體元件（啓動子、Cas9變體、熒光标記和藥物篩選标記）來定制表達月刀Cas9的gRNA。此外，我們還(há又著i)提供多合一和雙載體系統，可用常規質粒、慢病毒、AAV、腺病好拍毒和PiggyBac載體表達Cas9和gRNA。 我們全面(mi用睡àn)的CRISPR載體系列還(hái)包括以DN讀聽A模闆形式存在的基因打靶供體載體，以滿足精确指示序列變化的基因編輯需求，術裡比如通過(guò)HDR在目标位點進(jìn)行點突變那船和大片段敲入。此外，我們還(hái)提供CRISPRa和聽雜CRISPRi載體，分别用于實現靶基因的轉錄激活或音費抑制。我們提供的CRISPR基因表達調控載體包括基于dCas9朋店-SAM或dCas9-SunTag機用舊制的CRISPR激活和基于dCas9-KRAB或dCas9-友她KRAB-MeCP2機制的CRISPR抑制等應用類型。
將(jiāng)CRISPR載體添加到您的船土購物車時(shí)，您還(hái)可以在其下遊服務購舞雨買質粒DNA制備、RNA制備和病毒包裝。
注意：AAV基因組的裝載量爲4.7kb。來自Streptococcus pyog農市enes的常用SpCas9基因長(cháng)度爲4.2kb，當其他機與啓動子、polyA信号序列以和票及gRNA表達盒等其他組件組合時(shí)，整個序列幾乎無法裝入AAV飛還病毒。因此，我們的标準AAV CRISPR系統使用來自金黃色葡萄球菌（Stap舞爸hylococcus aureus）的較短的樂媽SaCas9（3.2kb）。請機房注意，SaCas9識别的PAM序列是NNGRR或NNGRRT（首選報聽），而SpCas9的PAM序列是N近西GG。我們還(hái)可以根據火票要求構建AAV SpCas9載體。
預制CRISPR載體
除了定制的CRISPR/Cas9載體，我月業們還(hái)提供預制的Cas9表達載體、gRNA載體以及适用于CRI區空SPRa和CRISPRi的輔助載體。我們的載體默認以甘油菌形式發(fā)見木貨。您也可以在載體設計的下遊服務進(jìn)一步訂購質粒DNA制備、木廠RNA制備以及病毒包裝等服務。能城
| 載體系統 | 載體名稱 | Vector ID |
|---|---|---|
| hCas9表達載體（質粒載體） | pRP[Exp]- mCherry/Hygro-CB靜件h>hCas9 | VB010000-9378bvk |
| hCas9表達載體（慢病毒） | pLV[Exp]- CBh>hCas9:T2A妹刀:Hygro | VB010000-9380sne |
| SaCas9表達載體（AAV） | pAAV[Exp]-CMV>SaC朋畫as9 | VB010000-9382per |
| hCas9表達載體（腺病毒） | pAV[Exp]-CBh>呢門hCas9 | VB010000-9381pwj |
| hCas9表達載體（piggyBac）麗海 | pPB[Exp]-mCherry/Hygro-CBh>hCas9 | VB010000-9379gqq |
| Scramble gRNA對(duì)照載體（質粒載體爸技） | pRP[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scrambl作拿e_gRNA | VB010000-9358ttk |
| Scramble gRNA對(duì)照載體（慢病毒） | pLV[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_見器gRNA | VB010000-9359hhe |
| Scramble SagRNA對(duì)照載體（AAV） | pAAV[SagRNA]-EGFP-U6>Scramble黃紅_SagRNA1 | VB010000-9361zjr |
| Scramble gRNA對(duì)照哥視載體（腺病毒） | pAV[gRNA]-EGFP-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9360nph |
| Scramble gRNA對(d北玩uì)照載體（piggyBac） | pPB[gRNA]-EGFP/Puro-U6章書>Scramble_gR大他NA1 | VB010000-9362zu相場k |
| hCas9與scramble gRNA共表達載體（質粒載體）能一 | pRP[CRISPR]-EGFP/Puro-hCa紙鐵s9-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9354ztt |
| hCas9與scramble gRNA共表達載體（慢病電鐘毒） | pLV[CRISPR]-hCas9/Puro-U6聽校>Scramble_gRNA1 | VB010000-9355sqw |
| SaCas9與scramble SagRNA 共表達載體（AAV）農器 | pAAV[CRISPR]-SaCas9會新-U6>Scramble_SagRNA | VB010000-9357zmm |
| hCas9與scramble gR相會NA共表達載體（腺病毒） | pAV[CRISPR]-hCas9家們/EGFP-U6>Scram光來ble_gRNA1 | VB010000-9356pna |
| dCas9-SAM激活系統的MS2/P65/HSF1表達載體（慢廠微病毒） | pLV[Exp]-EF1A>MS2/公麗P65/HSF1/Hygro | VB010000-9383ffr |
| dCas9-SAM激活系統的dCas9/VP64表達載體（慢病毒） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9384wwc |
| dCas9-SAM scramble msgRNA對(duì)照載體（慢病毒）廠土 | pLV[msgRNA]-EGFP/Puro-U6>Scram秒術ble_gRNA | VB010000-9363gsm |
| dCas9-KRAB-MeCP2表達載體（慢病毒） | pLV[Exp]-CBh>dCas9/ KRAB/MeCP2:T2A:Hygro | VB010000-9386mwf |
CRISPR病毒包裝
慢病毒、AAV 和腺病毒被(bè上些i)廣泛用于將(jiāng)CRISPR組分遞送至哺乳海件動物細胞中。雲舟生物提供優質的慢病毒、AAV 和腺病毒包裝服務，低友幫助您在難轉染細胞中實現高效的CRISPR基因編輯。我們的病毒包裝使用我們專哥笑有的技術和自我研發(fā)的試劑，大大改進(j場從ìn)了産毒的滴度、純度、活性和一緻性。我們的包裝方案還(h為商ái)會(huì)針對(duì)我們的農白載體構建服務中使用的病毒載體系統進(jìn)行優化。
CRISPR（3+1）套裝
如果您需要同時(shí)訂購多個CRISPR慢病毒，我們推薦您訂中快購我們的CRISPR（3+1）套裝。如果您僅需要訂購3個用于CRISPR風新實驗的gRNA慢病毒載體，我們亦提供CRISPR什海載體構建3件裝：
| 服務名稱 | 價格（CNY） | 周期 | |
| CRISPR慢病毒載體（3件裝）構建 | ￥1,980 | 4-7天 | 訂購咨詢 |
| CRISPRi慢病毒載體（3件裝）構建商暗 | ￥1,980 |
gRNA和Cas9 mRNA
雲舟生物可提供用于轉染和微量注射的Cas9 mRN個開A和gRNA，這(zhè)些Cas9 mRN上務A和gRNA專門爲靶向(xiàng)用戶選擇的目标位點而設計，并且有喝厭助于 RNA 組分成(chéng)功遞送至做讀哺乳動物細胞中。我們的Cas9 mRNA可用于表達野生紙哥型 hCas9或 Cas9 切綠購口酶（Cas9(D10A)）。我們的gRNA設計和評分使舞明用了CRISPR文庫設計（CLD）中的規則，并應用一組經(jīng)驗規則來錯森設計針對(duì)用戶選擇的基因/位費一點的最佳gRNA。
| 名稱 | 規格 | 價格（CNY） | 周期 | |
|---|---|---|---|---|
| hCas9 mRNA | >500 ng/ul，25 ul，林木無酶水，無菌 | ￥2,980.00 | 2-4天 | 訂購咨詢 |
| Cas9(D10A) mRNA | ||||
| 定制的gRNA* | ￥2,580.00 |
用于精确基因編輯的供體DNA
雲舟生物提供線性化質粒形式的ssODN或dsDNA的供體DN科年A模闆，用于指導基于HDR機制的DNA修複，從而在讀呢CRISPR切割位點精确地進(jìn)行DNA序列編輯，這(zhè)通常西要包括點突變以及小片段或大片段敲入。ssODN可用于在目标位又低點插入短的DNA序列（<60bp），比如小标簽或限花線制性酶切位點，而dsDNA供體則可用于靶向(南問xiàng)敲入較大的序列（長(cháng)達4-5kb）裡年，例如熒光标簽和其他報告基因。
| 名稱 | 價格 | 周期 | |
|---|---|---|---|
| ssODN（通常爲120-200 nt） | ￥2399.00起(qǐ) | 2-3周 | 訂購咨詢 |
CRISPR文庫
雲舟生物專門爲常用的CRISPR應用定制技飛并構建各種(zhǒng)文庫，包括用于基因功能(n西窗éng)篩選的敲除文庫、用于基因獲得性功能(nén做是g)篩選或非編碼區域調節功能(néng)篩選的視線CRISPRa文庫，以及用于基因化南功能(néng)喪失篩選或非編碼區域調節功能(néng)篩風好選的CRISPRi文庫。此外，我們還(hái)可以構建友如用于單細胞篩選的CRISPR bar在離code文庫，以及利用其它CRISPR技術構建的文庫
我們可以根據您的需求，將(jiān工是g)您的文庫以甘油菌、質粒DNA或病毒形式提供。我們的定制文庫均經(jī筆道ng)過(guò)NGS測序驗證。
除了定制的CRISPR文庫外，我們還(hái)提供預制的雙gRNA慢病毒文服雜庫，用于人類和小鼠的全基因組基因敲除篩選。對(duì)于基讀麗因敲除篩選，雙gRNA文庫比單gRNA文醫機庫更強大，因爲通過(guò)一對(duì)針對(duì)同一基因的g睡城RNA引入大片段缺失所在産生功紙雨能(néng)喪失突變比使用單個gRNA具有更高的效率。人姐術和小鼠雙gRNA文庫以預制的高滴度慢病毒的形式制成(chéng)，分雨來别靶向(xiàng)20,048個人的和購要20,493個小鼠基因。每個基因都(照厭dōu)被(bèi)不同載體上的4-6對(duì器市)不同的gRNA冗餘地靶向(xià銀這ng)。
CRISPR系統解決方案
CRISPR系統的多功能(néng)性使其适用于哺乳動物細胞中唱微的各類基因編輯應用。我們的技術團隊在分子生物學(xué)應用方面(mi道車àn)擁有豐富的經(jīng)驗，可以爲您的所有CRISPR基因編輯項目提弟還供完整的技術方案。我們可以幫助您處理下面(miàn)列出的常見CRISP樹風R應用，或與您合作開(kāi)發(fā)任何新的CRISPR應用。立即向討術(xiàng)我們發(fā)送設計請求，以獲得免費的服務方案。
CRISPR基因編輯原理
常規使用的CRISPR系統由兩(l從畫iǎng)個組分構成(chéng窗相)：Cas9蛋白和向(xiàng)導RNA（Guide RNA視但，gRNA）。最常用的Cas9是從Strepto討紅coccus pyogenes細菌中通過(gu民一ò)基因工程獲得的（又名SpC體場as9或hCas9）。它是一種(zhǒng) RNA 森子引導的 DNA 核酸酶，可以在靶位點産生DNA雙鏈斷裂 (Double str很妹ands DNA break，DSB)（圖1）。另一種(zhǒng)廣泛使用我輛的Cas9變體，即具有“切口酶”性質的林不Cas9，比如Cas9(D10A)，可對(duì)DNA單鏈進(jìn)行切割票公。如果將(jiāng)Cas9切口酶與兩(liǎ就花ng)個gRNA同時(shí)使用，并且兩視冷(liǎng)個gRNA分别靶向(xiàng音綠)位于單個目标區域兩(liǎng)照照側的兩(liǎng)條相反DNA鏈，則切口酶將亮算(jiāng)在每條鏈上産生一個單鏈切口，從而導問少緻目标區域發(fā)生DSB。一旦通過(guò)CRISPR系統産生DSB，細書影胞就(jiù)會(huì)激活非同源末新老端連接 (Non-homologous End Joi雪熱ning-NHEJ，NHEJ) 途徑來修複DNA斷裂，這(zhè)通畫對常會(huì)導緻少量堿基的随機缺失，或者發(光答fā)生更罕見的堿基插入和堿基替換等突變。當這(zhè)些突變破壞國上了蛋白質編碼區的序列時(shí)（例如發(fā)生移碼突變畫要），則可能(néng)引發(fā)功能(néng)性的基因敲除。
圖1 CRISPR引發(fā)的DNA修複機制
另一種(zhǒng)情況是，當共同引入人去外源的供體DNA模闆和CRISPR組件時(shí黃技)，細胞可以通過(guò)同源重組修複 (分討Homology directed repair，HDR)吧雨 途徑修複DSB。這(zhè)種(zhǒng)修複方式效率較低新女，并導緻目标基因組DNA序列被(bè和些i)供體序列替換，該機制有利于精确地改秒熱變DNA序列，例如産生點突變或在目标位點敲入供體DNA序列。供體公體DNA模闆可以是單鏈寡核苷酸（ssO空風DN）或dsDNA 片段（通常是線性化的質粒DNA）。ssODN适用于引入點風綠突變或小标簽插入，而dsDNA片段則更适煙舊用于大片段敲入。
圖2 RNP法驗證基因敲除效率。通過(guò)gRNA-Cas信一9核糖核蛋白（RNP）方法獲得純合敲除突變。（A）編黑路輯過(guò)的RNP複合物通過(guò)電轉法導入靶細胞，分離單克隆細胞慢國并篩選。使用PCR和Sanger測序驗證細胞的基因型。（B）本案例在飛在小鼠結腸癌細胞中進(jìn)行基因編輯。RNP通過(guò吃年)電轉進(jìn)入細胞後(hòu)，可以結合靶基因的兩(liǎng)個位點以不金敲除一段長(cháng)13 kbp的頻內區域。P1-P4四條引物用于三個PCR反應以區分敲除和野生型音現克隆。（C）PCR結果驗證了克隆1的睡中的純合敲除突變，并進(jìn還書)一步在（D）靶基因測序結果中得到印證。
催化活性失活的Cas9（dCas9）可以與不同形行計式的轉錄複合物結合以實現CRISPR介導的内源性基因轉錄調控。對(duì)于快紅轉錄激活，通常可使用協同激活介導系統（Synerg不民istic Activation Me自門diator，SAM）。該系統使用了三種(zh慢習ǒng)組件：dCas9/VP64融合蛋白、MS2/P65/HSF1輔助蛋白、書離以及一個修飾的gRNA。dCas9蛋白經(民朋jīng)過(guò)改造結合了VP64，一種(zhǒng)協同轉錄激嗎醫活因子，而經(jīng)過(gu從什ò)修飾的gRNA則含有一個MS2适配體，可以招募MS2複合物。MS2複西刀合物包含轉錄激活結構域NF-kB (p65)和HSF1。VP64包含去唱四個來源于單純疱疹病毒蛋白16的重複序列，其C計日端融合至Cas9蛋白使其可以招募轉錄激活相秒市關的蛋白來激活基因表達。p65和HSF1下西的轉錄激活結構域還(hái)可以作爲潛在的轉錄激活因子招募與啓動子或增強子結體看合的輔因子。總而言之，dCas9/VP64和MS2/P65/的輛HSF1複合物可以協同工作的方式以激活靶基因表達，如圖3所示。除了SAM系統，雲舟生物還(hái)可以提供dCas9-新章VP64-p65-Rta（VPR）轉錄激活結構作理域，使用EB病毒R順式激活因子替換HSF1轉錄激活結構域。
相對(duì)的，如果需要抑制靶基因表達，dCas9也可到計以被(bèi)改造爲含有一個轉錄抑制結構域，如離河KRAB（krüppel-associated b森藍ox）結構域和MeCP2。我們可提供兩(liǎng)種(z白動hǒng)dCas9/KRAB輔助載體：原版的以及改造優化後(hòu)和兒的兩(liǎng)個版本。該改造版本將(制鐵jiāng)dCas9同時(shí)融合到舞了兩(liǎng)個轉錄抑制結構域KRAB/MeCP2朋志，以便提供針對(duì)靶位點效果更強的轉錄抑制。當gRNA招募dCa小到s9/KRAB/MeCP2到内源性啓動子藍是，如圖3所示，轉錄被(bèi)抑制。KRA購黃B結構域常在人的轉錄因子中被(bèi)找到，是人類基因組中所間道發(fā)現的最常見的強效轉錄抑制因子之一。MeCP2可以通過男說(guò)招募組蛋白脫乙酰基酶，造成(chéng)染色質凝聚和表觀遺傳抑制子鐘，進(jìn)一步增強KRAB介導的轉錄抑制效果。CRISPR基因調控可以畫對被(bèi)用于大量的應用場景，比如測試染色質上的調控元件對不、調控目的基因的表達、以及全基鐘哥因組篩選等。
圖3 基于慢病毒的CRI朋近SPRa系統的基因上調表達效果。（A）SAM複合物示意圖什短。首先向(xiàng)NIH3T3細胞共轉導兩(服問liǎng)種(zhǒng)分别攜帶dCas9:VP64和MS2:P65:H舊河SF1的慢病毒，進(jìn)行抗志鄉性篩選。然後(hòu)使用遞送msgRNA的第三種(zh要金ǒng)慢病毒轉導細胞，并用另一種(zhǒng)抗生素進(jìn)裡術行篩選。（B）針對(duì)靶向(xiàng)mBrn熱也2基因啓動子區域而設計的msgRN師他A。（C） 通過(guò)qRT-PCR測量mBr舊算n2的相對(duì)基因表達，量化了使用Scramble、林器msgRNA以及空白對(duì)照（NC）轉導的件行并經(jīng)過(guò)抗市微性篩選的NIH3T3細胞中mBrn2轉錄産物表達量。Mean&場又plusmn;SD，*P<0.05，Turkey事(shì)後月為(hòu)檢驗。
圖4 基于慢病毒的CRISPRi基因抑制表達效果。劇去（A）轉錄阻遏複合物示意圖。首先向(xiàng)Jurkat細胞轉導攜帶d少長Cas9:KRAB:MeCP2的慢著媽病毒以表達轉錄阻遏複合物，然後拿區(hòu)進(jìn)行抗性篩慢兵選。然後(hòu)用另一種(zhǒng車視)慢病毒轉導細胞以表達scramb討見le或者gRNA，并進(jìn)行額外的抗性篩選中秒。（B） 靶向(xiàng)CXCR4基因啓動子區的gRNA。（C）少站 通過(guò)qRT-PCR測量CXCR4的相對(duì)舞紅基因表達，量化了使用Scramble、gRNA得業以及空白對(duì)照（NC）轉導的病經(jīng)過(g還工uò)抗性篩選的Jurkat細胞中CXC區線R4轉錄産物表達量。Mean±SD，**樹睡*P<0.001，****P&業慢lt;0.0001，Tukey事(shì)後(hòu)檢驗。（D） 通過(g文銀uò)western blot證實了含有打靶gRNA的Jurkat細胞中的CX城兒CR4表達水平下調。（E）向(xiàng)細胞表面(miàn)表達信見有CXCR4蛋白的Jurkat細胞行老轉導scramble以及打靶CXCR4的gRNA，使用流式細胞術驗證。CX雨愛CR4使用單克隆一抗（Ab）标記，并連接帶有熒光基團的二抗。陰性對(duì)照內飛中的Jurkat細胞隻使用了無标記的二抗。（F）轉導了打靶CXCR4的黃可gRNA的Jurkat細胞相較于轉導了scr錢公amble gRNA的平均減少了50%車們細胞表面(miàn)的CXCR4含量老兵。Mean±SD。
CRISPR基因遞送方法
CRISPR組件可以通過(guò)不同的方式引入哺乳動物細胞内（圖5）：
圖5 遞送CRISPR組分至細胞内的方法
下表展示的是每種(zhǒng)遞送方式的優勢與不足，有助于謝算爲您選擇合适的CRISPR遞送系統提供參考：
| 遞送方法 | 優勢 | 不足 |
|---|---|---|
| gRNA與Cas9質粒 |
|
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| gRNA與Cas9病毒 |
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| 混合的gRNA和Cas9 mRNA |
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| 有功能(néng)的gRNA-銀購Cas9 RNP複合物 |
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|
gRNA數據庫
雲舟生物的線上CRISPR載體設計工具可提供針對(duì)人類、小鼠以及動煙大鼠全基因組的gRNA數據庫，旨在幫助您快速設計具有高打靶效率的CR師影ISPR載體。我們的gRNA設計和評分使用了CRISPR文庫設男藍計（CLD）中的規則，即對(duì)于一個打靶某個物種(zhǒng)中的N(不我20)NGG序列的給定的gRNA，我們搜索該物種(zhǒng)基因組中的知麗所有潛在脫靶位點，且與目标序列比對(duì)≤3個爸鄉錯配堿基。以這(zhè)種(zhǒng)方式識雨個别的每個潛在脫靶位點，都(dō聽們u)會(huì)計算一個脫靶分值。 然後(hòu)將(我影jiāng)所有脫靶位點的分值彙總用于計算gRNA的最終特劇雜異性分值，該數值介于0到100之間，值越高表示靶向(xiàng)特異性裡影越強。請注意，特異性分值隻是一是女個粗略的指導。實際的打靶效率和特異性可能(néng)紙城與預測值不同。得分低的gRNA可能(néng)仍然有術劇效。
當您在我們的線上平台上設計CRISPR載體時(shí)，您可以在我畫舞們的數據庫中搜索您的目标基因。 輸入基因名稱後(hòu資購)，您將(jiāng)在我們的中歌數據庫中看到針對(duì)您的舞務目标基因的所有可用的gRNA的詳細信息。 我們的全基因組 gRNA 數麗舊據庫可讓您輕松地爲您的目标基因挑選合适的向(銀愛xiàng)導序列，同時(shí店秒)無需自行查找和分析打靶位點，對(上議duì)比常見的gRNA設計工具有著(zhe)無可比拟的優勢。
此外我們的在線“學(xué)習中心”包含豐富的學(xué)習資源用北，可幫助您安排并實施您的CRISPR實驗。
暫無
爲了确定哪種(zhǒng)方法最嗎的适合您的實驗應用，以下是您應該考慮的一些事(shì)項。
基因敲低載體
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過(guò)引發(f光飛ā)mRNA的切割抑制翻譯過(guò)程。shRNA為關敲低不改變靶基因的DNA序列。
基因敲除載體
CRISPR和TALEN都(dōu間睡)是通過(guò)指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā長遠)揮作用。然後(hòu)這(zhè)些切割位點被(bè雪腦i)細胞低效地修複，從而導緻修複部唱鐘位的永久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè)類突變坐上的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼、出現提前終止密碼子等，最終導緻目玩外的基因的功能(néng)喪失。如果同時(shí)靶向知動(xiàng)基因組中兩(liǎng)個相制雪鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以訊謝導緻其間區域的删除。
shRNA敲低永遠不會(huì)完全抑制靶基因的表達。雪照即使對(duì)于最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會(hu厭美ì)保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過(guò)處理的細胞群中，CR慢生ISPR和TALEN可以産生永久性突變，這(zh花老è)可能(néng)導緻基因功能(néng)完全喪失。
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時(shí)獲得較好(hǎo)請麗的均一性，實驗之間的一緻性也較佳。相比之下，由于引入突變是随機的，CRISPR拿笑和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。爲了完全能店敲除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。鑒于正常訊錢細胞具有任何基因的兩(liǎng)個拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可但這以具有兩(liǎng)個以上的拷貝，這(zhè)種(zhǒng)完全白黃敲除的細胞可能(néng)隻占所有處理後(hòu)的細胞的一小部分也書。出于這(zhè)個原因，核酸酶介導的敲除實驗需要通過(guò)測序來篩睡業選克隆，以确定所有目的基因拷貝都(喝民dōu)被(bèi)敲除的子細胞群。
已有報道(dào)表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的基因敲除均會說理(huì)産生脫靶效應。脫靶效應的表征可以通過(信錢guò)使用多個不同的shRN對木A 靶向(xiàng)同一基因來評估。如果一個基因被(bèi)在多個不同的作鐵shRNA作用下仍然表現出一緻討錢的表征，則這(zhè)種(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應紅開帶來的。對(duì)于CRISP內快R或TALEN基因敲除，應分析含有功能(néng)子動喪失突變的多個克隆，以包含可能(néng)由脫靶突變引起(qǐ)靜答的任何表征。此外，可以對(duì)區地克隆進(jìn)行脫靶位點測序，通過(guò)生物信息學(xué)計雜方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。
CRISPR系統和TALEN系船腦統均能(néng)用于在體外細胞和模式生物這(zhè)種(zhǒng)黑東進(jìn)行基因編輯。以下是這(zhè)兩(媽到liǎng)種(zhǒng)系統的特性對(duì)比：
CRISPR
CRISPR系統使用位點特異的向(xiàng)導RN志低A (gRNA) 將(jiāng)Cas9核酸酶引她湖導至其基因組中的目标位點以産生DNA切割。靶序列的長(chán嗎們g)度通常約爲20 bp。若靶序列中包含一些錯配位點仍可能(néng)被(b人看èi)識别和切割。
TALEN
TALEN系統使用的是一對(d鐵影uì)嵌合蛋白，每個嵌合蛋白包件到含一個融合到Fokl核酸酶結構域的且作爲TAL效應子的DN朋間A結合結構域（識别特定DNA序列）。這(zhè)對(duì)蛋白被(bèi)相銀設計成(chéng)與基因組中的一對(duì)靶位點結合，每個靶位點長(算師cháng)約18 bp，且二者相隔一個道那14-20 bp的間隔區。在與 DNA 結合後(hòu)，這西志(zhè)對(duì)蛋白上的Fo離作kl核酸酶結構域發(fā)生二聚化，然後(hòu)導緻兩(liǎng)個山笑靶位點之間的間隔區内的序列發(fā)生切割。
CRISPR和TALEN系統均在基因編輯上均表現出良好東技(hǎo)的效率，這(zhè)也具體取決于應用的物街他種(zhǒng)和細胞類型。一般來說(sh工民uō)，CRISPR系統的組分進(jìn)入細胞後(hòu)引發(習低fā)的DNA切割比TALEM系統更高效。
CRISPR系統的gRNA靶向(xiàng)約20 b雨藍p的DNA序列，而TALEN系統需要約36 bp的靶序列。此外，Cas西要9/gRNA 複合物對(duì)靶序列中堿基錯配（最多5 bp錯門議配）的容忍度高于 TALEN。因此，TALEN介導的D雨雪NA切割比CRISPR具有更好(hǎo)的特異性，也不太可能(néng)在化有基因組中發(fā)生脫靶性的切割。相外話比之下，已有報道(dào)表明CRISPR系統在體外細胞系中書煙可産生脫靶效應，而對(duì)C妹花RISPR敲除小鼠的分析則表明體内實驗做用時(shí)脫靶頻率較低。最新的CRISPR系統的身購顯著(zhe)增強了CRISPR的特異性。通過(g事朋uò)使用雙gRNA和Cas9切口酶（僅包含一個具有催化活性的核酸酶結構域站答的Cas9突變體，如Cas9(D10A)和了兵Cas9_H840A），在靶向(xiàng)區域附近産生兩(liǎng少愛)個單鏈DNA切口，從而導緻DSB發(fā)生在可修複的靶向(xi謝他àng)區域内。在這(zhè)種(zhǒng)設計中由如綠于雙gRNA可將(jiāng)靶向(xiàng)序列的長(ch市拍áng)度擴展至約40 bp，因此最大限度地減少了脫靶效問問應。
TALEN系統可以針對(duì)基因組中的幾乎任何位置進(地可jìn)行設計。相比之下，CRISPR系制鐵統中的靶位點選擇受限于PAM序列（通市雜常爲NGG）的要求，該序列位于gRNA靶向(xiàng)的DNA序花吧列的3'末端。CRISPR系統的這(zhè)種(zhǒng)校地特性這(zhè)并不會(huì)阻礙基因敲除，因爲對(duì)靶河飛基因中的任何地方切割都(dōu)是有效的基因編輯，但可能(néng)難以對(d煙術uì)基因的特定位置進(jìn)行切割或實現位人話點的特異性突變。爲了通過(guò)將(jiāng)CRIS麗還PR系統應用于可精确編輯特定基說道因組位點，可以將(jiāng)包含校弟所需編輯序列的同源重組供體載體或長(cháng)寡核苷酸與靶位術上點的上遊和下遊同源臂一同遞送至細胞中，以指導靶位點發(fā)生HDR介導的DN和關A修複。
在基因編輯實驗中，使用CRISPR亮公系統在幾個方面(miàn)表現出對(duì)比TA大呢LEN具有更低的技術難道(dào)。 首先，對(du關個ì)于載體構建，CRISPR 系統隻需要合成(ch跳得éng)一個短的gRNA，因爲Ca物能s9/gRNA 複合物的靶向(xiàng)依賴于機制簡單的RNA/DNA雜開能交，而TALEN 系統需要根據每個獨特的蛋白-DNA相互影制作用重新設計TAL的DNA結合域。與T近門ALEN系統相比，gRNA顯然是更愛懂便宜、更容易設計和構建的，而且TALEN系統打靶每個位花暗點總是需要兩(liǎng)個載體店討。其次，對(duì)于一些應用，例如注射小鼠胚胎，Cas9蛋白和gRNA可以通務動過(guò)直接注射來高效地遞送，但TALEN系統不能(néng)。最後(h新匠òu)，CRISPR系統在基因篩選實驗中的綠林應用非常廣泛，表達數千種(zhǒn件但g)不同gRNA的CRISPR篩選文庫可以很容易地以高通量方式構建。
對(duì)于CRISPR介導的基因編輯，C麗河as9核酸酶通過(guò)特異性的gRNA作用村錯至靶位點以産生DNA切割。在大多數情況下，討答爲了實現簡單的基因敲除，可以將(jiāng)單個gRNA與C報著as9共同使用以産生DSB，然後(hòu)通過(guò)NHEJ進(商請jìn)行低效率的DNA修複，從而導緻序列發(fā)生永久銀愛性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè)類突報朋變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼、出現提前終止密碼子等，最終問裡導緻目的基因的功能(néng)喪失。
雙gRNA則一般用于結合Cas9(白科D10A)切口酶對(duì)靶位點的票喝兩(liǎng)條反向(xiàng)DNA鏈進(jìn)行姐地切割。在這(zhè)種(zhǒng)方法中，切口酶將(jiāng)討亮在兩(liǎng)條鏈上産生單鏈切割，每一條鏈上的切割位點通說吃過(guò)兩(liǎng)條gRNA中的一條引導，然後(hò的好u)在靶位點産生DSB。一般來說(shuō)，這(zhè)種(麗木zhǒng)方法減少潛在的脫靶效應，因爲該種外呢(zhǒng)DSB的産生要求兩(liǎng)條錢用gRNA同時(shí)靶向(xiàng)序列月見。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 雪都DNA 模闆將(jiāng)特定的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時(吃就shí)，也可以使用雙gRNA。在這(你的zhè)種(zhǒng)方法中，兩(liǎng)如大條反向(xiàng)的DNA鏈將(jiāng)被(bèi)兩(議資liǎng)個gRNA靶向(xiàng)位于所需突變位家機點兩(liǎng)側的兩(liǎng)個位點麗照，然後(hòu)通過(guò)HDR途徑利用外源DNA供體坐吧模闆來修複切除的序列。
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