冠狀病毒S蛋白假病毒

病毒進(jìn)入宿主細胞的第一步是結合到細胞表面(miàn)，這(zhè)議妹個過(guò)程是由病毒表面(m輛這iàn)的特異性受體蛋白與細胞表面(miàn)受體的互補配對(duì)介導的。體有對(duì)于包膜病毒，如冠狀病毒和慢病毒，信做其最外層由一層磷脂雙分子層構成(c線門héng)，而病毒受體蛋白包被(bèi子紙)于膜上并且向(xiàng)外突出。對(duì)于無包膜病毒，如腺病毒和腺相關坐城病毒（AAV），其最外層爲蛋白質衣殼。無包膜病毒的病毒受體蛋白是其衣殼的紙唱一部分。

冠狀病毒的刺突蛋白（S蛋白）在病毒包膜外産生刺突形狀并形成(chéng)花冠去我一樣(yàng)的結構，冠狀病毒的名稱由此而來。這(zhè)些多一刺突首先幫助病毒依附在宿主細胞表面(miàn)，然後(hòu)介導病毒包膜與笑站細胞膜的融合從而讓病毒顆粒進(jìn)入細西用胞。

冠狀病毒包含大量的擁有不同宿主嗜性化高的病毒類型。一種(zhǒng)給定的冠狀病毒通常隻能(néng)飛朋有效感染一種(zhǒng)或幾種(zh能很ǒng)宿主，這(zhè)是由于器章一種(zhǒng)給定病毒類型的S蛋白隻能(néng)特異地與它的宿校呢主受體結合導緻的。比如說(shuō)，很有SARS-CoV和SARS-CoV冷爸-2，可分别引起(qǐ)SARS和COVID-19，它們的S靜還蛋白通過(guò)與人類呼吸道(dào)、肺以及上皮細胞的表土訊面(miàn)ACE2受體結合感染人類。另費子一方面(miàn)，MERS-CoV，引起(qǐ)了MERS，通過(guò)體長與人DDP4受體結合進(jìn)入人體細胞。

使用假病毒研究冠狀病毒侵入細胞方式

對(duì)于理解冠狀病毒如何進(jìn)鄉習入細胞，以及一種(zhǒng)藍購嗜性的冠狀病毒如何演化導緻病毒可以從一種(zhǒng)宿主小師跨物種(zhǒng)感染至另一種(zhǒng)宿主的背後(hòu)機制老長，研究不同冠狀病毒的S蛋白如何與它們的宿主受體結合是十分重要的。但是這(zh朋作è)樣(yàng)的研究通常難以實施，這(zh雪也è)是因爲一些有活性的冠狀病毒毒株是危險的，比如說(sh我年uō)SARS-CoV-2這(z制在hè)種(zhǒng)病毒隻能(néng)在生物安全三級鐵從（BSL-3）的實驗室進(jìn)行操作。

作爲使用活性冠狀病毒的替代方案，使用慢病毒、VSV病毒等工具病毒友業進(jìn)行人工重組獲得的S報舞蛋白假病毒是一個更可行的方向(xiàng北明)。這(zhè)些工具病毒與冠狀南分病毒一樣(yàng)都(dōu)是包膜病毒，冠狀區外病毒的S蛋白可以同樣(yàng)被(bèi)引入到工具病毒的包膜結構上。以S紙鄉蛋白包被(bèi)的假病毒可以模拟冠狀病風服毒結合細胞表面(miàn)受體進(jìn)入細胞的過(guò)公要程。用于制備假病毒的工具病毒本身是十分安全的，可以整合任嗎那何類型的冠狀病毒的野生型或者突變型的S行也蛋白。

載體家提供多樣(yàng)化的S蛋白假病毒。都吃這(zhè)些不同類型的S蛋白來自于種(zhǒng)類文件繁多的各種(zhǒng)冠狀病毒家族。不同的病毒載體可以表遠話達不同的報告基因，如EGFP或者熒光素酶制對，從而實現對(duì)病毒進(jì匠紅n)入宿主細胞的過(guò)程監測。

試驗驗證

我們開(kāi)發(fā)了一系列專有技術用以優化我們的病毒假型化工月中藝。經(jīng)我們優化後(hòu)的假病毒章影，對(duì)比通常方式包裝的假病毒具有更高的轉導效率。我們的假病毒通過制數(guò)了實際的實驗測試，以下實驗結果展示了在ACE2過(guò)表達293內頻T細胞中分别轉導SARS-CoV-2 S蛋白假慢病毒和SARS-C子服oV-2 D614G突變型S蛋白假慢病毒的感染效了行果。轉導後(hòu)細胞使用熒光報告基因（圖1）和螢火蟲熒光素酶報告基因（圖2年吃）标記，顯示無/低ACE2表達鐵農的293T細胞無法有效被(bèi)們離轉導，而高ACE2表達的293T細胞可以被(bèi)有效轉導。我們建短計議使用我們的ACE2過(guò)表達細胞株進(jìn)風機行S蛋白假病毒轉導。

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下方爲轉導測試（圖1、2、3）、熒友厭光素酶報告基因試驗（圖4）和Western很站 blot（圖5）。

圖1 293T細胞和表達hACE2的293T細胞使用以下假慢病毒轉導：分别攜間用帶野生型SARS-CoV-2（WT）、B.1.1.529（om草相icron）以及D614G S蛋白。沒(能明méi)有S蛋白的秃慢病毒用作陰性對(duì)照。轉導光商後(hòu)72 h成(chéng個服)像。

圖2 使用B.1.1.7和B.1.351路媽 S蛋白假慢病毒轉導293T（表達校金hACE2）細胞

圖3 使用B.1.1.7和B.1.351 S蛋白假慢病毒轉導2好聽93T（表達hACE2）細胞

圖4 使用SARS-CoV-2野生型S蛋白假慢病毒和D614G 問錢S蛋白假慢病毒轉導表達hACE2的293T細胞，表達熒光素酶基因。轉導後(h物上òu)72 h測定熒光素酶活性。背景信号已從每組的發(員科fā)光值中減去。

圖5 Western blot使用SARS-CoV-輛生2 S蛋白S2結構域抗體，展現了假病毒上的全長(chán生新g)和自我切割了S2結構域的S志討蛋白。注：冠狀病毒S蛋白在介導病毒感染細胞時(空鐵shí)會(huì)發(fā)生自我切割。泳道(dào)城火1：marker。泳道(dào)2：未白文轉導的293T細胞。泳道(dào)3：轉導學朋了VSV-G假慢病毒的293T細胞。泳道(dào)4：293T細胞隻轉導了家離表達S蛋白的輔助質粒。泳道(dào)5：293T細胞轉導下在了了S蛋白假慢病毒的包裝質粒。泳道(dào)6：VSV-美做G假慢病毒。泳道(dào)7：S蛋白假慢病毒。

假病毒所使用的刺突蛋白（S蛋白）類型

自然界中冠狀病毒是由一大群病毒組成(c黃自héng)的并可以感染我們所知的每一種(zhǒng錢分)哺乳動物。迄今已有數百種(zhǒng)冠狀病毒被(bèi)發放拍(fā)現。對(duì)于其中一些可以感染人類、牲口、寵物以及模式林員動物的類型，以及一些在演化上趨近于這(zhè)些類型的了睡，我們都(dōu)尤爲關注。這(zhè)些備受關注的重藍山要類型的冠狀病毒系統發(fā)育樹如下圖所示：

關于該些病毒的更多細節信息如下表所示：用身

載體家提供以上任何一種(zhǒng煙校)冠狀病毒類型的S蛋白假病毒包裝。說去我們同樣(yàng)可接收其他類型的S蛋白假慢中病毒包裝。

對(duì)于SARS-CoV-2 S蛋白假病毒包裝，我們有兩(li坐工ǎng)種(zhǒng)S蛋白供選銀一擇。我們默認選用的S蛋白序列來源于首次報錯近道(dào)的新冠病毒基因組序列（GenBank編号：銀鐘NC_045512.2）。然而随後(hòu)的研究發(fā)現，一些志生新冠病毒的S蛋白發(fā)生了D614G突變（GenBank編号：MT628063.1），顯著增強了病毒的感染能(néng)力。得益于其傳播優勢就東，S蛋白D614G突變型的新冠病毒已擴散到全球多個地區。載體家在此票可也進(jìn)一步提供該種(zhǒng)突變型S蛋白的假病毒包裝體路。S蛋白D614G突變型的假病毒可更有效地轉導ACE公月2表達細胞系。

載體家亦提供不含有任何包膜蛋白的“光秃型”慢病毒。該類型病毒可用于陰朋快性對(duì)照。