慢病毒載體（Lentivirus vectors）的特性：在非分新湖裂和分裂細胞中穩定整合、轉基因的長(ch樹花áng)期表達、低免疫原性，使其成(chéng)爲基因治療的理想基因轉移載銀事體。轉基因可以在非分裂或終末分化的非常靜止的細胞（例如神經(討放jīng)元）中實現。我們的慢病司匠毒載體來源于HIV-1病毒，序列經(森河jīng)過(guò)精心優化地都，提高了生物安全性、基因表達水平和病毒轉導效率。慢空城病毒顆粒通常是在包裝細胞中共表達病毒體包裝元件和載體基因組來産生廠道的。我們開(kāi)發(fā)慢志出了一系列專有技術和試劑，從病毒滴度、純度、活性以及一緻性等方面(湖線miàn)提升了慢病毒包裝工藝水平的國。除了科研級别的慢病毒外，我們還(hái)提供GMP級别的慢病毒制備服務。
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 二代慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 二代慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 非整合型慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 非整合型慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 非純化慢病毒制備服務 | 純化慢病毒制備服務 | |
| 交付内容 | 定制病毒，按照規格交付：
| 定制病毒，按照規格交付：
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對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(d有窗uì)應贈送：
| 對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
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| Polybrene（5 mg/ml，車學200 ul），贈送 | Polybrene（5 mg/ml，200機唱 ul），贈送 | |
輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
| 輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì空如)應選購：
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| 病毒重懸液 | HBSS緩沖液 | HBSS緩沖液 |
| 運輸/存儲 | 幹冰/-80°C，避免反複火朋凍融 | 幹冰/-80°C，避免反複凍融 |
| 推薦應用 | 體外培養細胞轉導 | 體外培養細胞轉導、動物體内細胞轉導 |
對(duì)照病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我們按照“對(d喝外uì)照病毒與定制病毒的生物學(xué)雜去應用相匹配”的原則給您贈送或者推薦對(duì)照病鐵自毒。例如，如果定制病毒表達一個基因，則推薦的對(duì)照病毒表醫新達熒光蛋白EGFP。如果定制病毒表達打靶某個基用放因的shRNA，則對(duì)照病毒表達一個Scramble 報計shRNA。推薦的對(duì)照病毒信息如下表所示：
| 對(duì)照病毒 | 對(duì)照載體名稱 | 對(duì)照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對(duì)照慢病毒，EGFP司問/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[Exp]-EGFP:T2A:Pu行家ro-EF1A>mCherry | VB010000-9298rtf | 哺乳動物基因表達慢病毒（包含Tet-On誘導表達和FLEX條件性術關表達）、哺乳動物CRISPR慢病毒、哺乳動物非編碼RNA表做筆達慢病毒 |
| Scramble shRNA對(作銀duì)照慢病毒，EGFP熒光，Puro抗性 | pLV[shRNA]-EGFP/Pu中看ro-U6>Scramble_shRNA | VB010000-0009mxc | 哺乳動物shRNA幹擾慢病毒 |
| Scramble miR30-shRNA對(duì)照慢病毒，草呢EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[miR30]-EGFP/Puro黑愛-EF1A>mCherry:Scramble_miR30-shRNA | VB010000-9387zjj | 哺乳動物miR30-shRNA幹擾慢病毒 |
| TRE-mCherry對(duì)照慢病毒，EGFP/mCherry雙姐行熒光，Puro抗性（選購） | pLV[TetOn]-EGFP/Puro-TR拿煙E>mCherry | VB010000-9449uj書問z | 哺乳動物基因Tet-On誘導表計很達TRE慢病毒 |
| FLEX-mCherry對(duì)照慢病毒，EG匠火FP/mCherry雙熒光，Puro會明抗性（選購） | pLV[FLEXon]-EGFP/Puro-EF1A>拿花LL:rev(mCherry):rev(LL) | VB010000-9324qqg | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
輔助病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我們按照“輔助病毒與定制舊到病毒的生物學(xué)應用相匹配學人”的原則給您推薦輔助病毒。例如，如果定制病毒是一個隻含TRE啓動子的T坐舊etOn慢病毒，則需要一個表達rtTA的輔助病毒，才能(né低業ng)進(jìn)行誘導表達實驗。推薦的輔助病毒信息如下表所示：
| 輔助病毒 | 輔助載體名稱 | 輔助載體ID | 定制病毒 |
| Cas9慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CBh>hCas9/Hygro | VB010000-9380sne | 哺乳動物gRNA慢病毒（不含Cas9） |
MS2/P65/HSF1慢病毒（dCas9-S舞北AM系統元件之一），Hygro抗性（選購睡你） 注意：該ORF序列存在特殊結構，使用其生産的慢病毒的滴度有可開還能(néng)會(huì)比同規格慢病毒的保證滴度低1-10倍。 | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P65/HSF1/Hygro | VB010000-9383ffr | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統元件可公之一） |
| dCas9/VP64慢病毒（dCas9-SAM系統元件司請之一），Bsd抗性（選購） | pLV[Exp]-EF1A&g長文t;dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9384wwc | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統元件之一） |
| Cre慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>Cre/Hygro | VB010000-9372bck | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
| tTS/rtTA慢病毒，Hygro抗性（選購）慢體 | pLV[Exp]-CMV>tTS/rtTA/森村Hygro | VB010000-9369xhm | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
我們的慢病毒存儲在HBSS緩沖液中，并采用幹冰運自弟輸。收到慢病毒後(hòu)，立要他即放置于-80℃，長(cháng)期貯存至少6個月。慢病毒的保光西質期約爲一年。請避免反複凍融，通舊因爲這(zhè)會(huì)導緻慢病毒滴度大幅下降。
| 步驟 | 描述 | 時(shí)間 |
Co-transfection | 我們常規使用的第三代慢病毒包裝系統包括1個轉移質粒（Tr門樹ansfer plasmid）、1個東風膜蛋白表達質粒（Envelope plasmid）、2農影個包裝質粒（Packaging pl線東asmids），將(jiāng)這件什(zhè)些質粒共轉染包裝細胞。2個子作包裝質粒分别爲Gag/Pol表達質粒和務日Rev表達質粒。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在細胞裡(lǐ)，轉移質粒轉錄出攜帶目的基海見因（Gene of Interest，簡稱GOI）的HIV RN作森A基因組，與包裝質粒表達出的衣殼結構西小蛋白、酶、調控蛋白組裝成(chéng)病算區毒顆粒後(hòu)，轉運到細胞膜内側，形成(chéng)包膜病毒分泌到胞外。玩厭膜蛋白質粒表達的VSV-G膜蛋白民機錨定在細胞膜上，随著(zhe)病毒成(嗎路chéng)熟，與細胞膜一起(qǐ)成(chén窗可g)爲了病毒的膜。細胞短暫孵育後(hòu)師的，收集上清，離心去除細胞碎片并過(guò)濾報腦。 | 第3天 |
Concentration and pur電東ification | PEG濃縮病毒顆粒。對(duì)于超服拍純化慢病毒（體内應用級别），采用蔗糖離心方法進(jìn)一步純化自吧、濃縮病毒。 | 第4天 |
Quality Control | 對(duì)病毒進(jìn)行滴度測定（Titer determinatio習海n）、微生物檢測（Bioburden test，針對(duì)細菌、真菌議很）、支原體檢測（Mycoplasma test）等。 若轉移載體同時(shí)編碼一個熒光蛋白，我和村們還(hái)會(huì)將(jiāng)病毒進(jìn)行細胞轉導以測定兒著相應的熒光表達情況（Transduction tes近們t）。此外，對(duì)于超純化慢病毒，我們還(hái)可以檢測内毒素問花水平（Endotoxin test）。 | 第5天及以後(hòu) |
注意：第三代慢病毒包裝系統隻能(nén人知g)包裝第三代的慢病毒轉移載體。但是第二代慢病毒包裝系統既能(néng)包裝化務第二代，也能(néng)包裝第三代的慢病毒轉移載體。門麗第三代慢病毒轉移載體上的5’ LTR中的U3元件是被(bèi)一紙微個外源啓動子替代（如CMV啓動子或者RSV啓業議動子），使其不依賴Tat蛋白進(jìn)行HIV R都還NA基因組的轉錄，故第三代慢病毒包裝系統的包裝質粒不含T公明at蛋白。第二代慢病毒轉移載體上的5’ LTR是野生型的LTR，含有U3、R兵通和U5元件，依賴Tat蛋白轉錄H視分IV RNA基因組，故第二代慢病毒包裝校黑系統的包裝質粒含有Tat蛋白。
我們的滴度保證僅适用于這(zhè)購煙樣(yàng)的轉移載體
對(duì)于如下這(zhè)樣(yàng)的轉移呢間載體，我們不能(néng)保證滴度：朋購
交付周期是指訂單接收到發(fā)貨之間的時(shí)間，不歌拿包括需要客戶提供任何物料（如病毒載體）的等待線他時(shí)間。對(duì)于不含有熒光标記，但是含有藥篩标記的病毒載兒水體，如果您需要獲得細胞藥篩效果的質檢結果，由于細胞生長(cháng)狀态需要較拿看長(cháng)時(shí)間觀察中到，周期將(jiāng)額外增加術街8-10天。
如需客戶提供慢病毒載體，則請按照外來物品接收指南將(jiāng)載體寄送給我們。請嚴格按照我們的指匠劇南來進(jìn)行裝運以免造成(chéng)物品的任何延誤和秒來損壞。客戶提供的所有材料均需經(jīng)過(guò)QC檢測，每海習一份材料附加檢測費用。請注意，客戶提供物品接收并明上通過(guò)QC之後(hòu)生産才正式開(kāi)始匠外。
慢病毒轉導
使用說(shuō)明書
慢病毒體外應用慢病毒載體系統經(jīng)曆了至少三代演變發(fā)展，随著(zhe)代快算次更新，生物安全性逐步提高。第一代暗票系統（1st generation）雖然使用了三站少質粒系統，但是仍保留了大部分HIV基因組，安全性欠佳，現已基本淘汰。相街可比第一代系統，第二代系統（2nd generation）剔除了與病毒相又複制相關的Vif、Vpr、Nef等輔助基因，僅保留了與病毒好影轉錄、組裝相關的Gag、Pol、T花民at和Rev基因。值得注意的是，第二代系光購統的轉移載體是使用野生型 5‘ LTR啓動子轉錄HIV船這 RNA轉錄本的。野生型 5‘ LTR啓動子依賴子快Tat蛋白的結合才能(néng遠雪)激活其轉錄活性，所以第二代慢病毒的包裝必須使用第二代系統話音的包裝質粒，因爲它能(néng)表達Tat蛋白。
第三代系統（3rd generati商長on）在第二代基礎上做了這(zhè)些改進(jìn)：
1. 包裝質粒被(bèi)拆分成(chéng)兩(l通器iǎng)個，分别表達Rev和Gal/Pol，進(jìn)一步降低了包裝質嗎數粒和轉移載體在包裝過(guò)程中産生DN森窗A重組的幾率，從而降低形成(ch明區éng)複制型病毒的風險；
2. 包裝質粒上Tat基因被(bèi)去除，進(jì匠讀n)一步降低緻癌的風險（Nunnari G 2008)。而轉移載體上的野生型5’ L上愛TR元件改造成(chéng)Hy公風brid 5' LTR，删除了U3區域，并融合了強啓動子，朋西如CMV或者RSV啓動子，可以不依賴Tat轉錄HIV 北一RNA；
3. 3’ LTR的U3區域被(bèi)删除，不能(néng)將(著紅jiāng)完整的3‘ LTR複廠水制到5' LTR上，原病毒DNA就(jiù)不能(néng)自我轉錄生成兵藍(chéng)新的病毒RNA，具有這(zhè)個特征的病毒被(bèi愛遠)稱爲自我失活型（Self inactivation，簡美件稱SIN）。第三代系統需要轉染四個質粒（1個轉移載體銀紙、2個包裝質粒、1個包膜蛋白表達質粒），對(刀麗duì)生産技術要求更高一些。第二代慢病毒包裝家暗質粒可以包裝第二、第三代的轉移載體，而第三代慢病明劇毒包裝質粒系統缺少Tat，不能(néng)包裝員又第二代轉移載體。
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | hAd5隻感染表達CAR受體的細胞 | 取決于血清型 |
| 是否可感染非分裂細胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因組穩定整合抑或遊離于宿主基因組 | 穩定整合 | 穩定整合 | 遊離的DNA附加體形式 | 遊離的DNA附加體形式 |
| 自定義啓動子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 應用 | 細胞培養和體内實驗 | 細胞培養和體内實驗 | 體内實驗 | 體内實驗 |
| 體内免疫反應 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我們使用p24 ELISA法測定慢病毒滴度。拍黑該方法的三明治免疫試驗可測定HIV-1 核心蛋關現白p24在慢病毒上清液中的含量水平。我們首先在微量滴定闆上加入慢病毒樣(yà東雜ng)本，然後(hòu)每孔加入HIV-1 p24捕獲抗體進(jìn)行孵育，請鐵并随後(hòu)添加生物素化的p24二抗以結合票遠p24一抗。此後(hòu)，樣(yàng)本中加入的辣根過(guò)氧化物酶（算紅HRP）标記的鏈黴親和素可特異性結合生物素化的p24二抗如身。在最後(hòu)一步中，加入辣根過(guò)氧化物酶底物反應液，經(jīng為紅)HRP催化産生有顔色的産物。每個孔的顔色飛雪深度最終反映了慢病毒樣(yàng)本中的p24含量。使用分光光度計筆理測量的樣(yàng)本吸光度數值與重組HIV-1的件雨 p24标準曲線進(jìn)行對(duì)照，然後(hò空路u)被(bèi)換算爲對(duì)應的慢病毒滴度影船。
野生型慢病毒HIV-1的基因組長(c術站háng)度約爲9.2 kb，這(zhè)也是重組慢病毒載體的承載限木化度範圍。載體上能(néng)包裝進(jìn)病毒的區域長(cháng)度還花爲從5’ LTR的R元件的第一個堿基到3’ LT體笑R的R元件的最後(hòu)一個在場堿基。超出承載量的片段插入則會(現得huì)造成(chéng)病毒包裝滴度降低。
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