CRISPR/Cas9系統是當今炙手可熱的基因編輯工具，可以通雜白過(guò)NHEJ途徑敲除目的基因，或通過(guò)同源重組敲除、敲入或标記吧新基因。此外，Cas9經(jīng)過作信(guò)改造成(chéng)爲沒(méi)有剪切活性的Cas9（d學學ead Cas9， dCas9）歌大後(hòu)，還(hái)可以充當基因表達討爸的可編程阻遏物，從而用于構建CRISPRi基因抑制表達系統。對(duì)于CR下議ISPR基因編輯應用，我們提供傳統和非整合型兩(liǎng)種(zhǒ空慢ng)CRISPR慢病毒。對(d謝明uì)于CRISPRi基因抑制應視朋用，我們提供的CRISPRi慢病毒套裝包含2種舞劇(zhǒng)病毒：gRNA慢病毒和dCas火分9-KRAB-MeCP2慢病毒。
CRISPR（3+1）慢病毒套裝（整合/非整合慢議路病毒）
| 服務名稱 | 生産規格 | 交付内容 | 套裝價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPR（3+1）慢病毒套裝制備 | 小規格 |
| ￥7,680.00 | 11-22天 |
| 中規格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大規格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超純化中規格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超純化大規格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上價格和周期包含載體構建
CRISPRi（3+1）慢病毒如小套裝
| 服務名稱 | 生産規格 | 交付内容 | 套裝價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| CRISPRi（3+1）慢病毒套裝制話白備 | 小規格 |
| ￥7,680.00 | 11-22天 |
| 中規格 |
| ￥10,080.00 | ||
| 大規格 |
| ￥15,980.00 | ||
| 超純化中規格 |
| ￥19,580.00 | ||
| 超純化大規格 |
| ￥23,380.00 |
注意：以上價格和周期包含載體構建
當前我們提供慢病毒類型的CRISPR（3+1）和CRISPRi頻著（3+1）套裝。這(zhè)些CRISPR載體系統均經(jīng)可土過(guò)我們專門優化，在大腸業體杆菌中具有高拷貝複制、可包裝産生高滴度病毒并且對(duì)于靶細胞多煙具有可靠的轉導效率。
我們的CRISPR慢病毒載體能(néng)將(jiāng)C船請RISPR/Cas9系統整合進(jìn)細胞基因組中，随細胞分裂而分裂，實現C爸吧as9和gRNA的長(cháng)期穩定表達。如果制相選擇非整合型慢病毒進(jìn)行包裝，這(zhè)種(zhǒng)會朋慢病毒轉導細胞後(hòu)由于其突變的整合酶沒(méi)市作有功能(néng)，病毒DNA不插入鐘林細胞基因組并且以非複制型遊離體存見站在于轉導細胞中，則轉導進(jìn)細胞的Cas9和gRNA不能(nén城請g)持續表達，有助于降低脫靶風險。
在CRISPRi系統中，dCas9是與KRAB和MeCP2阻遏域融合在一起(刀喝qǐ)的，具有強大的基因阻遏功能(néng)。與shRNA綠男相比，CRISPRi系統可以沉默更多類型基因，如蛋白編碼基因、非編碼RN年文A、microRNA等。對(duì)于我們的CRISPRi海見慢病毒套裝，其gRNA慢病毒攜帶Puromycin抗性基農開因，而dCas9-KRAB-MeC和你P2慢病毒攜帶Hygromycin抗性基因。進(jìn)行實驗時市體(shí)，使用Puromyci村這n和Hygromycin兩(liǎng)種(zhǒng)抗生素篩選轉導細胞。
暫無
爲了測定慢病毒的滴度，我們使用系遠計列稀釋的慢病毒轉導293T細胞，然後(hòu)使用街務qPCR的方法來定量測定每個宿主細胞基因組（使用BMP2拷貝數作爲内參吧討）中病毒基因組（使用WPRE拷貝數作爲參照）整合的平均拷貝數。這(z文男hè)種(zhǒng)方法能(néng)夠測定病毒的功員區能(néng)滴度，精确地反映出具有感染能(néng)力樹是的病毒顆粒的數量。另外，還(hái)有其章劇他測定病毒滴度的方法，其中一種(zhǒng)是對(duì)病毒基因組RN白機A直接進(jìn)行RT-qPCR來測定，但這(zhè)種(土體zhǒng)方法會(huì)嚴重高北得估病毒的滴度（通常約10倍，有時(shí)高達100倍），因爲它測量國見的是所有病毒的基因組，包括無活性的病毒顆粒。由于慢病如嗎毒本身的不穩定性，如果病毒不儲存于-80℃或被(b討費èi)反複凍融，都(dōu)會(huì)使得無活性病媽他毒顆粒增加。另一種(zhǒng)方法是基于病毒載體上攜帶的熒光或藥物一服篩選标記的表達量來測定轉導細胞的數量。該方法可能(né工又ng)會(huì)嚴重低估病毒滴度，因爲熒光或城中藥物篩選标記可能(néng)由于沉默或其他原因未能(光船néng)在一些宿主細胞中被(bèi)檢測到，而有的謝有細胞可能(néng)會(huì)被(bèi)多個病毒顆粒感染。
對(duì)于CRISPR介導的基因組編輯，Cas子拿9核酸酶靶向(xiàng)位點特異性引導RNA（gRNA）的靶位點以産子火生DNA切割。在大多數情況下，爲了産生簡單的基因敲除，可以將(jiāng)影中單個gRNA與Cas9一起(qǐ)使用以産生雙鏈斷裂（D海妹SB），并通過(guò)非同源末端連接（NH友讀EJ）低效修複，導緻永久突變 ，如在修複位點産生小插入或缺失。某些突變會(議拿huì)産生移碼，終止密碼子提前出現等和制，從而導緻目的基因功能(néng)缺失。如果基因組中兩(liǎng)個臨鐵愛近的位點（如小于幾kb）同時(shí)作爲靶向(xiàng)位點，子現使用雙gRNA可能(néng)會(huì)導緻中間頻呢區域片段的缺失（即片段敲除）。
如果使用Cas9_D10A缺刻酶靶向(xiàng)單個靶房體位點的兩(liǎng)條相對(duì)鏈，則可影討以使用雙gRNA。缺刻酶將(jiāng)在兩(liǎng)條鏈還人上産生單鏈切割，兩(liǎng)條gRNA分别引導缺房愛刻酶在對(duì)應的一條鏈上進(jìn)行切割，從而引起(qǐ)靶位點處發自日(fā)生DSB。 通常情況下，這(站微zhè)種(zhǒng)方法可以減火地少CRISPR/Cas9的脫靶效應，因爲需要兩(liǎng)個gR報北NA同時(shí)打靶才能(néng)産生DSB。
當使用Cas9_D10A缺刻酶和外源Donor DNA模闆將(ji拿月āng)特定堿基（例如敲入）引呢女入目的基因時(shí)，也可以使用雙gRNA。兩(liǎng)林有個gRNA靶向(xiàng)位于所需突變話子位點側翼的兩(liǎng)條相對(duì)鏈，然後(hòu)通過(g紅樂uò)同源定向(xiàng)修複（HDR）的方法利用喝個外源模闆來修複被(bèi)切除的序列。
| shRNA | CRISPRi | |
|---|---|---|
| 工作原理 | 基因敲除能(néng)通過(guò)short hairpin RN路高As（shRNAs）實現。shRNA表達後(hòu)，被(bèi)加⼯成說歌(chéng)small interfering服了 RNAs（siRNAs）。這(zhè)些siRNA被(bèi)運吃自到RNA-induced silen票對cing complex（RISC）那裡(lǐ)。接著(zhe)，si黃有RNA的反向(xiàng)鏈與正向(xiàn嗎秒g)鏈解開(kāi)，正向(xiàng)業草鏈被(bèi)降解、丢棄，反向(xiàng)鏈繼續與RISC複合國畫物結合，將(jiāng)有活性的RISC複合物引秒海導⾄與反向(xiàng)鏈互補的m樹鐵RNA。⼀旦反向(xiàng)鏈與mRNA完全購林互補結合，RISC複合物中的⼀個蛋白，argona懂黃ute，會(huì)剪切mRNA，從而抑制mRNA編碼的蛋⽩翻譯表達。 | CRISPR interference（CRI哥低SPRi）技術采⽤了⼀個nuclease-dead Cas9蛋白（dCas9）動文與轉錄抑制因⼦組成(chéng)日們的融合蛋白，例如Kruppel-ass劇哥ociated box（KRAB）轉錄抑制因子。在這(zhè)個融合蛋劇房白裡(lǐ)，dCas9仍然保留與DNA結合的活性，但是人短失去了核酸酶活性。dCas9融合蛋⽩亮在在⼀條guide RNA（gR鐵多NA）引導下，結合至目标基因的transcriptional 藍紅start site（TSS）區域，從而阻遏該基因的轉錄。 |
| 目标分子 | 成(chéng)熟mRNA | 基因的TSS區域 |
| 打靶事(shì)件發(fā)⽣位置 | 細胞質 | 細胞核 |
| 抑制基因種(zhǒng)類 | mRNA編碼基因、胞質lncRNA | mRNA編碼基因（針對(duì)因轉錄本太短而不要有能(néng)設計出有效shRNA的基因，可選擇CR火她ISPRi技術）、胞質lncRNA、核内lncRNA |
| 脫靶⻛險 | RNAi存在2類脫靶：序列相關性和非司民序列相關性序列相關性脫靶：僅憑有限的部分堿基互補，siRNA就們下(jiù)能(néng)引起(qǐ)離花非目标mRNA的沉默。取決于siRN刀樹A序列，⼀個siRNA可能(néng)抑制成(chén志術g)百上千條轉錄本。非序列相關性脫靶：sh慢玩RNA采⽤内源miRNA通路實現基因敲除。當⼤量shRNA導⼊細胞務服後(hòu)，它們使RNAi系統達到飽和，并與内源miRNA競争蛋白商男，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些内又些源miRNA介導的基因調控受到幹擾，導緻不黑機可以預期的脫靶。 | 與shRNA相比，CRISPRi的脫靶機率超低。 |
| 可逆的基因抑制 | 如使⽤質粒載體或者合成(chéng)的siRNA，基因沉默是可逆的。如使⽤整畫樹合型病毒載體（如：慢病毒載體）實現長鐵結構性表達shRNA，則沉默非可逆性。 | 如使⽤質粒載體或者合成(chéng)分音的dCas9融合蛋白/gRNA，基因沉默是票店可逆的。如使⽤整合型病毒載體（如：慢病毒說費載體）實現結構性表達dCas9融合蛋白和gRNA，則沉默非可逆性。如沉默村區重要的基因，推薦使⽤TetOn誘導表達CRISPRi慢病毒劇美載體，可通過(guò)藥物控制這(zhè)些基從子因的沉默。 |
我們使用的gRNA設計和評分規則與張峰實驗室開(kāi)發(fā)的運算規讀鐘則類似。簡而言之，對(duì)于每個物種(銀小zhǒng)，我們找出符合N(20)NGG規則的靶序列，數坐把錯配堿基 ≤3的序列列爲潛在的脫靶位你報點，計算出每個gRNA的脫靶分值，進(jì有暗n)而得出最終的gRNA特異性分值。gRNA特異性分值在0-1議知00之間，分值越大靶向(xiàng)特異性越高。
請注意特異性分值隻是一個參考值。實際的靶向(xiàng)效率和特異性可能(電拍néng)會(huì)與預測的分值有偏差，低分值的gRNA也可能(néng購朋)有較好(hǎo)的靶向(xiàng)效民請果。
服務商工作站 >>
