對(duì)于CRISPR介導的基因編文裡輯,Cas9核酸酶通過(guò)特異性的g來笑RNA作用至靶位點以産生DNA切割。在大多數情況微們下,爲了實現簡單的基因敲除,可以將(jiāng)單個gRNA與Cas9計著共同使用以産生DSB,然後(hòu)通過(g輛拍uò)NHEJ進(jìn)行低效率廠些的DNA修複,從而導緻序列發(fā)生永久性突變,化事比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè)類突變的一部分會(huì)費了導緻基因的閱讀框移碼、出現提前終止密碼子等,最終導緻目的基因的功能(nén明刀g)喪失。
雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶對(duì)靶位點的兩(li答做ǎng)條反向(xiàng)DNA鏈進(jìn紅我)行切割。在這(zhè)種(zhǒng)方法中,切口酶哥妹將(jiāng)在兩(liǎng)條鏈上産生單鏈切割,每一條鏈上的切割位點通過行就(guò)兩(liǎng)條gRNA中的一條引導,然後(hò科林u)在靶位點産生DSB。一般來說(shuō),這(zhè在要)種(zhǒng)方法減少潛在的脫靶效應,因爲該種(zhǒng)DSB的北要産生要求兩(liǎng)條gRNA同時(機金shí)靶向(xiàng)序列。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 DNA 模闆將(jiāng)特定的厭鐵堿基(例如敲入)引入感興趣的基因時(shí),也可以吧水使用雙gRNA。在這(zhè)種(體又zhǒng)方法中,兩(liǎng)條反向(空兒xiàng)的DNA鏈將(jiāng)被(bè水長i)兩(liǎng)個gRNA靶街林向(xiàng)位于所需突變位點兩(liǎng)側的兩(liǎng)個位點,然自個後(hòu)通過(guò)HDR途和視徑利用外源DNA供體模闆來修複切除的序列。明關