技術詳情
shRNA具有其特有的莖環結構,在RNA幹擾(RNAi)過女輛(guò)程中發(fā)揮著(zhe)至關重要的作話了用,可精準降解mRNA。shRNA轉錄形成(chén空老g)發(fā)夾結構後(hòu),可識别并降解靶mRNA。s聽錢hRNA文庫是大規模功能(néng)缺失篩選的強大工具。根據您的研子美究需求,雲舟生物提供多種(zhǒng)形式的shRNA文庫,影業包括E. coli菌株、質粒DNA和包裝好(hǎo)的病毒載體。這(zhè)遠市些文庫都(dōu)會(huì)進(jìn)行NGS店動測序驗證以确定文庫的質量。
圖 1 雲舟生物shRNA敲低慢病毒載體
圖 2. 慢病毒shRNA文庫介導的功能(néng)缺失篩選流程圖日討,摘自Acta Biochim Bi小著ophys Sin 44:103-112 (2012)員白
慢病毒shRNA文庫介導的基因篩選常規流程如圖2所示討分。首先,利用慢病毒shRNA文庫轉導靶細胞,并通過(guò)慢病毒載體上攜樂光帶的篩選标記(例如藥物選擇或熒光标記)來篩弟女選成(chéng)功轉導的陽性細胞。將(jiāng)陽性細胞分爲對(d站照uì)照組和實驗組,對(duì)實驗組進(j農玩ìn)行壓力選擇(如藥物處理或重複傳代),篩選出具有目的表型的細胞。基因什多功能(néng)篩選策略通常有三種(老話zhǒng)類型:1)活力篩選,篩選出shRNA富集或銳減廠風的活細胞; 2)報告基因篩選,篩選出報告基因的表達強度與shRN章謝A的富集有關的細胞(如靶向(xiàng)調節煙物報道(dào)基因表達shRNA);3)行爲篩選,篩選出shR美頻NA與細胞侵襲、遷移等基因相關的細胞。相對(duì)于對(d姐讀uì)照組,實驗組細胞篩選完成(ch鄉關éng)後(hòu),通過(guò)sanger測序或NGS測樂白序鑒定出富集或銳減的shRNA。通過(guò)下城話遊功能(néng)研究,進(jìn)一步分析富集或消減的shRN問場A可能(néng)靶向(xià鐵房ng)的候選基因。
實驗數據
圖3 shRNA均一性在人和小鼠精華基因小庫(針地書對(duì)PubMed Ce信們ntral上約2,000個最常被(bèi)引用的基因)中的草花分布。shRNA讀長(cháng)分布按要綠NGS文庫大小(1,000萬reads)标準化,并以log2匠風比例繪制。NGS測序深度爲300x。