雲舟生物的基因敲入穩轉細胞株可實現對(d到線uì)細胞基因組靶位點的永久敲入。我們的基因敲入細胞采冷妹用CRISPR相關技術制備，需要針數票對(duì)轉導細胞的靶位點導入一個特異性的gRNA/Cas9 RNP複合物理些，以及一個可通過(guò)HDR修複方式引入供體序列的供體載體。理司我們擁有一系列獨特的技術，可讓我們在很短的周期内實現具有高HDR率的高效基學得因遞送，高成(chéng)功率獲得敲入純合子。
亮點：
圖1 基因敲入穩轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲入細胞穩轉株構建（插入片段<3 kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥42,980起(qǐ) | 14-20周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
| 基因敲入細胞穩轉株構建（插入片段新暗>3 kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥69,980起(qǐ) | 18-25周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
* 增加交付單克隆數將(jiāng)收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲入驗證（默認） | 基因型PCR、Sanger測序 |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脫靶效應分析（額外收費） | NGS、PCR、Sanger測序 |
| 染色體分析（額外收費） | 核型分析 |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 CRISPR介導的iPSC基因敲入。通過山麗(guò)電轉法向(xiàng)iPSC中導入Cas9/gRNA RNP什看複合物和供體載體，成(chéng)功敲入UBC驅動表達的EG月煙FP（2432 bp）。（A）Sanger測序确認EGFP成(笑船chéng)功敲入靶位點。（B）基因型PCR分析四個敲入純合子的費暗單克隆。野生型（WT）靶點的長(chá務兵ng)度爲762 bp，敲入了EGFP歌我的靶點的長(cháng)度爲3194 bp。（C）顯微遠話鏡下的成(chéng)功敲入的細胞具有喝火EGFP熒光。（D）核型分析結果。（E）EGFP敲短風入的iPSC中多能(néng)性标記物（NANOG、OCT動作4和SOX2）的免疫熒光結果。
基因敲除依賴于非同源末端連接 (NHEJ) 介導的 CRISPR 引起(民呢qǐ)的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 修複，該機制容易出錯，移碼或片段删除（妹聽使用雙 gRNA 時(shí)）等突變會(huì舊樹)以一定頻率發(fā)生，導緻目标基因功能(néng)喪失。另一方面(miàn劇志)，基因敲入則依賴于同源定向(xiàng)修複（HDR）機制，可將自西(jiāng)供體片段精确插入靶位點，其效率比NHEJ低，且僅限用她店于分裂細胞。此外，HDR效率也因細胞類型而異。因此，基因敲入在技就船術上比基因敲除更具挑戰性。
選擇供體模闆的首要考慮因素是您的模闆大小。對(duì)于小片段插入（&l訊算t;10 kb）,ssODN通常是最佳的選擇大河，其HDR效率較高。對(duì行信)于大片段，可因情況選擇使用線性dsDNA（細胞毒性較高，HDR率高）或者師這環狀質粒載體（細胞耐受性好(hǎo的信)，HDR率低）。
藥篩後(hòu)獲得陽性轉導的混合細離個胞群。采用血細胞計數闆等工具确定細胞數量和濃度。對(什子duì)細胞進(jìn)行梯度稀釋，然後(hòu)在96孔闆中培養，并使其濃技為度爲<1 細胞/孔。單獨的細胞高些克隆將(jiāng)被(bèi)分離并擴增，對(這一duì)其進(jìn)行基因型鑒定。
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