慢病毒載體（Lentivirus vectors）的見但特性：在非分裂和分裂細胞中穩定整合、轉基因的長(cháng)期海樂表達、低免疫原性，使其成(chéng)爲基因治療的理想基因我作轉移載體。轉基因可以在非分裂或裡拿終末分化的非常靜止的細胞（例如神經森術(jīng)元）中實現。我們的慢病毒載體來源于HIV-1病毒，序列經(場要jīng)過(guò)精心優化，提高了生物安全性、基因表達水平和病毒筆鄉轉導效率。慢病毒顆粒通常是在包裝細胞中共表達病毒體包裝元件南笑和載體基因組來産生的。我們開(kāi)學廠發(fā)出了一系列專有技術和試劑，從病毒滴度、純度、樹器活性以及一緻性等方面(miàn)提升了慢病毒包裝工藝水平。除了科研從外級别的慢病毒外，我們還(hái)提供GMP級别的慢病毒制備服務。
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
| 二代慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 二代慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化二代慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 生産規格 | 總量 | 最小滴度 | 分裝 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|---|---|
| 非整合型慢病毒小量制備 | >2.5x107 TU | >108 TU/ml | 10x25 ul | ￥3,180.00 | 6-12天 |
| 非整合型慢病毒中量制備 | >108 TU | >108 TU/ml | 10x100 ul | ￥4,680.00 | |
| 非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥7,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒中量制備 | >5x108 TU | >109 TU/ml | 10x50 ul | ￥9,780.00 | |
| 超純化非整合型慢病毒大量制備 | >109 TU | >109 TU/ml | 10x100 ul | ￥11,880.00 |
| 非純化慢病毒制備服務 | 純化慢病毒制備服務 | |
| 交付内容 | 定制病毒，按照規格交付：
| 定制病毒，按照規格交付：
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對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(duì)腦好應贈送：
| 對(duì)照病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
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| Polybrene（5 mg/ml，200 ul），贈送 | Polybrene（5 mg/ml，2銀業00 ul），贈送 | |
輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
| 輔助病毒，按照定制病毒的規格對(duì)應選購：
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| 病毒重懸液 | HBSS緩沖液 | HBSS緩沖液 |
| 運輸/存儲 | 幹冰/-80°C，避免反複凍融 | 幹冰/-80°C，避免反複凍融 |
| 推薦應用 | 體外培養細胞轉導 | 體外培養細胞轉導、動物體内細胞轉導 |
對(duì)照病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我東空們按照“對(duì)照病毒與定制病毒的生物時空學(xué)應用相匹配”的原則給光得您贈送或者推薦對(duì)照病毒。例如，如果定制病開短毒表達一個基因，則推薦的對(duì)照病毒表達熒光蛋白EGFP。如果定制病毒風報表達打靶某個基因的shRNA，則對(著事duì)照病毒表達一個Scramble shRNA。推薦水拍的對(duì)照病毒信息如下表所示：
| 對(duì)照病毒 | 對(duì)照載體名稱 | 對(duì)照載體ID | 定制病毒 |
| EGFP對(duì)照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性校路 | pLV[Exp]-EGFP:T2A:Puro-EF1A>mChe北子rry | VB010000-9298rtf | 哺乳動物基因表達慢病毒（包含Tet-On誘導表達和FLE關海X條件性表達）、哺乳動物CRISPR慢病毒、哺乳動物非編時煙碼RNA表達慢病毒 |
| Scramble shRNA對(du外討ì)照慢病毒，EGFP熒光，Puro抗性電微 | pLV[shRNA]-EGFP/Puro-U6&g白我t;Scramble_shRNA | VB010000-0009mxc | 哺乳動物shRNA幹擾慢病毒 |
| Scramble miR30-shRN拍答A對(duì)照慢病毒，EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性 | pLV[miR30]-EGFP/Puro-EF1A>mCherry:個錢Scramble_miR30-shRNA | VB010000-9387zjj | 哺乳動物miR30-shRNA幹擾慢病毒知朋 |
| TRE-mCherry對(duì)照慢病毒，EGFP/mCh水又erry雙熒光，Puro抗性（選購） | pLV[TetOn]-EGFP/Puro什秒-TRE>mCherry | VB010000-9449ujz | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
| FLEX-mCherry對(duì)照慢病毒，雪開EGFP/mCherry雙熒光，Puro抗性（選購）來見 | pLV[FLEXon]-EGFP/Puro-EF1A&線她gt;LL:rev(mCherry):rev(LL)暗話 | VB010000-9324qqg | 哺乳動物基因FLEX條件性表達慢病毒 |
輔助病毒
爲了更好(hǎo)地開(kāi)展您的實驗，我們按照“輔助病毒與定制病讀國毒的生物學(xué)應用相匹配”的原則給您推薦輔助病毒。例如，如果定制病毒是農道一個隻含TRE啓動子的TetOn慢病毒，則需要一個表達rtTA的輔助病毒，習懂才能(néng)進(jìn)行誘導表達實驗。推薦的輔助病毒信嗎訊息如下表所示：
| 輔助病毒 | 輔助載體名稱 | 輔助載體ID | 定制病毒 |
| Cas9慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CBh>hCas9/Hygro | VB010000-938好算0sne | 哺乳動物gRNA慢病毒（不含Cas9）光相 |
MS2/P65/HSF1慢病毒（dCas9-SAM系統元件之大快一），Hygro抗性（選購） 注意：該ORF序列存在特殊結構，使用其生産的慢病毒的滴度有可能(néng)愛很會(huì)比同規格慢病毒的保證滴度低1-10倍。 | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P65慢海/HSF1/Hygro | VB010000-9383ffr | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統元件之一）區城 |
| dCas9/VP64慢病毒（dCas9-SAM系統元件之一），Bsd多長抗性（選購） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9頻器/VP64/Bsd | VB010000-9384ww國和c | 哺乳動物msgRNA表達慢病毒（dCas9-SAM系統元件之一） |
| Cre慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>Cre/Hygr冷雪o | VB010000-9372bck | 哺乳動物基因FLEX條件性表達科如慢病毒 |
| tTS/rtTA慢病毒，Hygro抗性（選購） | pLV[Exp]-CMV>tTS/rtTA/裡商Hygro | VB010000-9369xhm | 哺乳動物基因Tet-On誘導表達TRE慢病毒 |
我們的慢病毒存儲在HBSS緩沖液中，并采用幹冰運輸。收到慢病毒後(hòu)黃分，立即放置于-80℃，長(cháng)期貯存至少6個月。科用慢病毒的保質期約爲一年。請避免反複凍融，因道笑爲這(zhè)會(huì)導緻慢病毒滴度大幅下降。
| 步驟 | 描述 | 時(shí)間 |
Co-transfection | 我們常規使用的第三代慢病毒包裝系統包括1個轉移質粒（Transf東業er plasmid）、1個膜蛋白表達刀姐質粒（Envelope plasmid）、2個包裝質去睡粒（Packaging plasmids），將(有美jiāng)這(zhè)些質粒共和知轉染包裝細胞。2個包裝質粒分别爲G票月ag/Pol表達質粒和Rev表達質粒。 | 第1天 |
Supernatant collection | 在細胞裡(lǐ)，轉移質粒轉錄出攜白公帶目的基因（Gene of Interest，簡稱G大師OI）的HIV RNA基因組，與美了包裝質粒表達出的衣殼結構蛋白、酶、調控蛋白組裝成(chéng)病毒顆粒後(h了土òu)，轉運到細胞膜内側，形成(chéng)包膜病毒分泌到胞外。膜蛋白質粒表達電慢的VSV-G膜蛋白錨定在細胞膜上，随著廠資(zhe)病毒成(chéng)熟，與細胞膜一起(拍通qǐ)成(chéng)爲了病毒的膜。細胞短暫孵育後(h信秒òu)，收集上清，離心去除細胞碎片并過(guò)濾。 | 第3天 |
Concentration and 也少purification | PEG濃縮病毒顆粒。對(duì)于超純化慢病毒（去熱體内應用級别），采用蔗糖離心方法進(jìn)一步純化、濃縮病毒。 | 第4天 |
Quality Control | 對(duì)病毒進(jìn)行滴度測定（Tite話爸r determination）、微生物檢測身道（Bioburden test，針對(duì)細菌、真菌）、支原體日們檢測（Mycoplasma test）等。用弟 若轉移載體同時(shí)編碼一個熒光蛋白，我們還(há到男i)會(huì)將(jiāng)書森病毒進(jìn)行細胞轉導以測定相應的熒光來風表達情況（Transduction tes的湖t）。此外，對(duì)于超純化慢病毒，村要我們還(hái)可以檢測内毒素水平（Endotoxin test）。 | 第5天及以後(hòu) |
注意：第三代慢病毒包裝系統隻能(néng)包裝第三代的慢病毒轉移載體。但是第二紙問代慢病毒包裝系統既能(néng)包裝第二代，也能(néng)包多問裝第三代的慢病毒轉移載體。第三雨章代慢病毒轉移載體上的5’ LTR中的U3元件是被海關(bèi)一個外源啓動子替代（如CMV啓動子或者RSV啓動子），使其不依賴Ta樹站t蛋白進(jìn)行HIV RNA基因組的就南轉錄，故第三代慢病毒包裝系統的包裝她站質粒不含Tat蛋白。第二代慢病靜子毒轉移載體上的5’ LTR是野生有房型的LTR，含有U3、R和U5元件，依賴T章年at蛋白轉錄HIV RNA基因組，故第二代慢病毒包裝系統的包裝質粒和分含有Tat蛋白。
我們的滴度保證僅适用于這(zhè看東)樣(yàng)的轉移載體
對(duì)于如下這(zhè)樣(yàng)的轉移載體，我們不能(n鐘空éng)保證滴度：
交付周期是指訂單接收到發(fā)貨讀秒之間的時(shí)間，不包括需要客戶提供任嗎件何物料（如病毒載體）的等待時(shí)間。對(d土樹uì)于不含有熒光标記，但是含有藥篩标記的病毒載體，如果您需要獲得細胞為現藥篩效果的質檢結果，由于細胞生長(cháng)狀态需要較長(ch舞對áng)時(shí)間觀察，周期科來將(jiāng)額外增加8-10天。
如需客戶提供慢病毒載體，則請按照外來物品接收指南將(jiāng)載體寄送給我們子微。請嚴格按照我們的指南來進(jìn)行近照裝運以免造成(chéng)物品的任何延誤和損壞。客戶提供的要的所有材料均需經(jīng)過(gu刀器ò)QC檢測，每一份材料附加檢測費用。請注意，客戶提供物品學朋接收并通過(guò)QC之後(hòu)生産才正式人術開(kāi)始。
慢病毒轉導
使用說(shuō)明書
慢病毒體外應用慢病毒載體系統經(jīng)曆了至少三代演變發(fā)展，随著報都(zhe)代次更新，生物安全性逐步提高。第一代系統（1st g都分eneration）雖然使用了三質粒系統，但是仍保留了爸什大部分HIV基因組，安全性欠佳數很，現已基本淘汰。相比第一代系統，第二代系統（2nd 件用generation）剔除了與病毒複制相關的聽家Vif、Vpr、Nef等輔助基因，僅保留了與病毒轉錄、組裝相關就習的Gag、Pol、Tat和Rev基因。討子值得注意的是，第二代系統的轉移要爸載體是使用野生型 5‘ LTR姐校啓動子轉錄HIV RNA轉錄本的。野很樂生型 5‘ LTR啓動子依賴Tat蛋白的結合才能(néng)激能學活其轉錄活性，所以第二代慢病毒的關花包裝必須使用第二代系統的包裝質粒，因爲它能(né廠如ng)表達Tat蛋白。
第三代系統（3rd generation）在第城公二代基礎上做了這(zhè)些改進(jìn)：
1. 包裝質粒被(bèi)拆分成(chéng)兩但體(liǎng)個，分别表達Rev和Gal/Pol，進(jìn)一讀件步降低了包裝質粒和轉移載體在包裝過(guò)程坐男中産生DNA重組的幾率，從而降低形成(chéng)複制型病毒的兒街風險；
2. 包裝質粒上Tat基因被(bèi)去除，進(jìn)一步降低緻癌的那術風險（Nunnari G 2008)。而轉移載體上的野生型5’ LTR元件改造成(chéng)一風Hybrid 5' LTR，删除了U3唱為區域，并融合了強啓動子，如CMV或者RSV啓動子，可以草他不依賴Tat轉錄HIV RNA；
3. 3’ LTR的U3區域被(bèi)删除，不能(néng)將(ji厭報āng)完整的3‘ LTR複制到務門5' LTR上，原病毒DNA就(jiù)不能(néng)自我雨事轉錄生成(chéng)新的病毒RNA，具有這(zhè)聽照個特征的病毒被(bèi)稱爲自我失活型（S近白elf inactivation，簡稱SIN）。第三代西友系統需要轉染四個質粒（1個轉移綠農載體、2個包裝質粒、1個包膜蛋白東請表達質粒），對(duì)生産技術要求更高一些。舊房第二代慢病毒包裝質粒可以包裝第二、第三草中代的轉移載體，而第三代慢病毒包裝質粒系地市統缺少Tat，不能(néng)包裝第二代轉移載體。
| 慢病毒 | MMLV | 腺病毒 | AAV | |
| 組織嗜性 | 廣泛 | 廣泛 | hAd5隻感染表達CAR受體的細胞 | 取決于血清型 |
| 是否可感染非分裂細胞 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 病毒基因組穩定整合抑或遊離于宿主基因組 | 穩定整合 | 穩定整合 | 遊離的DNA附加體形式 | 遊離的DNA附加體形式 |
| 自定義啓動子 | 是 | 否 | 是 | 是 |
| 應用 | 細胞培養和體内實驗 | 細胞培養和體内實驗 | 體内實驗 | 體内實驗 |
| 體内免疫反應 | 低 | 低 | 高 | 非常低 |
我們使用p24 ELISA法測定在校慢病毒滴度。該方法的三明治免疫試驗可測定HIV-1 核心蛋白p24在慢高光病毒上清液中的含量水平。我們首先在微量滴定闆上加入慢病毒樣(y北木àng)本，然後(hòu)每孔國唱加入HIV-1 p24捕獲抗體進(jìn)行孵育，并随後(請區hòu)添加生物素化的p24二也做抗以結合p24一抗。此後(hòu)，樣(yàng)本中加入的辣根過(g腦哥uò)氧化物酶（HRP）标記的鏈黴親和素可件算特異性結合生物素化的p24二抗。在最後(對文hòu)一步中，加入辣根過(guò)氧化物酶底物反應液，經(jī麗匠ng)HRP催化産生有顔色的産物。每個孔的顔色深度最終反湖雨映了慢病毒樣(yàng)本中的p24含量。使用分光煙技光度計測量的樣(yàng)本吸光度黑場數值與重組HIV-1的 p24标準曲線進(jìn)行對(duì)照，然鐘票後(hòu)被(bèi)換算爲對(duì)應的慢病毒滴度。
野生型慢病毒HIV-1的基因組長(cháng)度約爲有些9.2 kb，這(zhè)也是重空姐組慢病毒載體的承載限度範圍。載體上能(néng)包裝店時進(jìn)病毒的區域長(cháng)度爲從5’ LTR風熱的R元件的第一個堿基到3’ LTR的R元件的最後(hòu)一個堿基。超出承空不載量的片段插入則會(huì)造成(chéng)病毒包裝筆人滴度降低。
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