雲舟生物可以爲您的目的基因構建敲低效果長務唱(cháng)效的細胞穩轉株。爲保證敲低效率，每個細胞株個子獨自接受來自3個shRNA慢病毒中的一個的病毒轉新女導。經(jīng)過(guò)RT-qPCR驗證，我們交付敲低效率最佳的雨森細胞株。此外，每批細胞産品放行前，我們還(hái)書空會(huì)開(kāi)展一系列QC試驗，比如無菌測試、書謝支原體檢測等。
亮點：
圖1 基因敲低穩轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低細胞穩轉株構建 | 多克隆細胞群（>106個細胞/管，2管） | ￥18,980起(qǐ) | 8-13周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株（>106個細胞/管，每個克隆各2管） | ￥23,980起(qǐ) | 13-18周 |
* 增加交付單克隆數將(jiāng)收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲低驗證（默認） | RT-qPCR |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 在Hep-G2細胞中高效敲低DNAJC裡遠12基因。（A）攜帶EGFP的DNAJC12 shRNA慢病放站毒轉導Hep-G2。（B）RT-qPCR檢測基因敲低效率信雪達90.9%。三次重複試驗；p value<0.001。
我們設計和評估shRNA的規則與RNAi cons看件ortium（TRC）使用的規則類似。對(duì)于秒美每個RefSeq轉錄本，我們會(huì)搜索出所有的21 mers作爲候選科西靶位點。以下因素會(huì)降低幹擾效率/特異性或影響克隆，含有拍明這(zhè)些特點的序列將(jiāng)會(h線我uì)被(bèi)排除。主要因公上素包括：含有≥4個連續相同堿基，含有≥7個G或C，GC含量<25％木體或> 60％以及序列的5'端含有AA堿基。如果靶點内部含有莖環結構自司，或是3'末端的GC含量較高，或是該靶點是已知的miRN男歌A核心序列或是會(huì)打靶到其他基因，則該靶點的分值就(j市快iù)會(huì)較低。若靶位點存在于一個基因的多個轉錄本，好員則該靶點的分值就(jiù)會(huì)較高器購。 所有的幹擾分值均≥0，平均數約爲5，标準差約爲5，95%的分值均鐵都≤15。若一個shRNA的幹擾分值是15，則表示具有老有很高幹擾效率且易于克隆；若幹擾分值爲0，則表示幹擾效果較差或難以克隆。
爲了确定哪種(zhǒng)方法最适合那店您的實驗應用，以下是您應該考慮的一些事(sh雪商ì)項。
基本原理
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過(guò)引發(老快fā)mRNA的切割抑制翻譯過(guò)程。s船子hRNA敲低不改變靶基因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都(dōu)是通過看站(guò)指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(fā)揮作用。人在然後(hòu)這(zhè)些切割位點被(bèi)細胞低效地修複，從而能線導緻修複部位的永久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿嗎去基缺失。這(zhè)類突變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼、出現提些地前終止密碼子等，最終導緻目的基因的功間如能(néng)喪失。如果同時(shí)靶向(xiàng)基因組中兩(liǎng窗生)個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb）現問，也可以導緻其間區域的删除。
效率
shRNA敲低永遠不會(huì)完全抑制靶基因的表達短學。即使對(duì)于最有效的shRNA，靶基因的一些市兒殘留表達也會(huì)保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過樹都(guò)處理的細胞群中，CRISPR和TAL費城EN可以産生永久性突變，這(zhè)可能(néng)導緻基因功能去月(néng)完全喪失。
一緻性和均一性
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時(shí)獲得較好(hǎo)的均一性多兵，實驗之間的一緻性也較佳。相比之下，由于引入突變是随機的，CRIS來化PR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大間妹。爲了完全敲除細胞中的目的基因飛得，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。日放鑒于正常細胞具有任何基因的兩(liǎng)個拷不開貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩(liǎng)個以上的拷貝，這(她光zhè)種(zhǒng)完全敲除的細化畫胞可能(néng)隻占所有處理後(hòu)的細胞的一小部分術媽。出于這(zhè)個原因，核酸酶介導的敲除實驗河火需要通過(guò)測序來篩選克隆，以确定所有目的基因拷貝都短路(dōu)被(bèi)敲除的子細胞群。
脫靶效應
已有報道(dào)表明shRNA介導的基因敲低和核山畫酸酶介導的基因敲除均會(huì)産生脫靶效應。脫靶效應的表征可以通過(g議會uò)使用多個不同的shRNA 靶向(xiàng)同一基因來評估。如多風果一個基因被(bèi)在多個不同的shRNA作用下仍然表現出一緻的表征，則拍歌這(zhè)種(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應帶來的。對(duì)于CR爸來ISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能(néng)喪失突變的哥要多個克隆，以包含可能(néng)由脫靶突變引起(qǐ)些購的任何表征。此外，可以對(duì)為雪克隆進(jìn)行脫靶位點測序，通過(gu學要ò)生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。
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