痘苗病毒（VACV）

服務詳情

服務類型

我們提供的VACV載體構建和病毒包裝服務如下：

• 使用VACV BACYAC骨架克隆的VACV載體，包括紅有WR毒株和MVA毒株
• VACV病毒包裝

VACV載體克隆

雲舟生物自主研發(fā)的“BACYAC”骨架訊去專門爲VACV載體克隆而設計。該骨事到架整合了細菌人工染色體（BAC）和工火酵母人工染色體（YAC）的關鍵元件。BAC相還在關元件允許該載體可以在大腸杆菌中木區以BAC形式擴增，而YAC相關元件允許該載體在釀酒酵母中複人吧制BACYAC載體因此可靈活地北店在大腸杆菌系統和酵母系統中進(jìn)行載體擴增和序列修飾。

EGFP/LacZ報告基因、BACYAC骨架序列、以及痘苗病公事毒啓動子被(bèi)克隆到J2R位點之間的TK（胸苷明就激酶）基因中，以獲得減毒重組載體。我們的減毒WR毒器看株和MAV毒株可以被(bèi)應用于基礎科研、臨床前試驗、臨床研究等領域。年短通過(guò)進(jìn)一步直接突變改造，我們還(hái)可以提供減毒國劇程度更高的痘苗病毒。

VACV BACYAC載體的基本設計如圖1所示。

圖1 含有EGFP或LacZ報告基因的VACV BACY樂空AC骨架

TK：胸苷激酶基因，在重組VACV中失活以産生減毒病毒文船。

p7.5：痘苗病毒啓動子。VACV在細胞質中複制需要痘苗病毒啓動子。中高 p7.5 通常用于驅動轉基因表達，因爲它在病毒複制的門近早期和晚期具有轉錄活性。

LoxP：Cre重組酶作用的重組位點。兩(liǎng)個L女書oxP之間的序列可以被(bèi)Cre重組黃低酶剪切下來。

ITR：痘苗病毒基因組兩(liǎng)端的反向(xiàng)重複序列，匠唱帶有VGF基因。

N2：N2基因在病毒早期感染時(shí)表達，抑制宿主免疫過(guò)程。

M1：M1基因可防止宿主細胞凋亡，增強病拍紙毒生産。

EGFP或LacZ報告基因： CMV啓動子驅動表達的EGFP和LacZ報告基因，用于識别業身轉染成(chéng)功的細胞。

BACYAC骨架：整合了細菌人工染色體（BAC）和酵母人工染色體（YAC體錢）的載體骨架，可以在大腸杆菌種(視務zhǒng)攜帶氯黴素抗性基因選擇性擴增，也可以在釀酒酵母中使用His3自噬選拿呢擇标記進(jìn)行擴增。

運輸與存儲

我們的VACV病毒保存于HBSS緩沖液，并以幹冰形式運輸。接收音說到病毒後(hòu)，VACV可以在-80&d技她eg;C長(cháng)期存儲（可至錢花少穩定存儲6個月），或者在-20°C存儲區個一周。VACV的保質期約爲1年。請避免反複凍融VACV以筆吧避免顯著的滴度下降。

VACV制備與質量控制

VACV包裝流程如圖2所示。攜帶目的基因的非感染性VACA BACYAC載體轉染哺乳動物細木內胞，同時(shí)轉導非複制型的雞痘病毒作爲輔助人媽病毒。由于VACV具有廣泛的組織嗜性，因此可用多種(zhǒ坐火ng)類型的細胞包裝生産VACV。雲兒通舟生物首先采用多種(zhǒng)類型的細胞用于VA學子CV的複蘇和擴增。我們使用嗜斑純化法初步獲得病毒克隆，商鐵然後(hòu)進(jìn)行病毒擴增。細胞外包膜病毒 (EEV) 和細自好胞内成(chéng)熟病毒 (IMV) 可以知他分别從上清液和細胞裂解液中收獲。EEV通過(guò)PEG濃縮後兒跳(hòu)，與IMV的病毒液合并。對(duì學線)于超純化VACV，病毒顆粒經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的蔗地費糖密度梯度離心以獲得純化和濃縮件年。

圖2 典型的VACV包裝流程。

對(duì)于每一個生産的重組VACV病毒，質量控制包括滴度檢測、雨體無菌測試、支原體檢測等。如果VACV病毒載體表達熒光通得蛋白，則我們會(huì)進(jìn做科)行熒光轉導測試。如果VACV病毒載體含有藥篩标記，我腦藍們也會(huì)在轉導測試後(hòu)伴随進(j年樹ìn)行藥篩測試。此外，對(duì)于超純化VACV，我票拍們會(huì)進(jìn)行内毒素檢測計冷。

試驗驗證

我們的VACV載體經(jīng)詳盡驗證可以穩定用于生産活病毒。 圖3顯示了經(jīng)我們性能(néng)驗車你證的VACV病毒轉導BHK21細胞的效果。

圖3 表達EGFP的VACV轉導BHK21細胞，MOI=0.5。轉導什遠後(hòu)0小時(shí)和72小時(shí)使用熒光顯微鏡成(chén拍懂g)像。放大倍數：100×。左：明場。右：EGFP。

VACV背景知識

VACV是一種(zhǒng)雙鏈線性DNA病毒，屬于痘病毒家房間族。它的基因組長(cháng)度約爲190 kb，可以插入大型轉基因（計可25-30 kb）。VACV的基因組複制和轉錄完全發(區呢fā)生在宿主細胞的細胞質中，病毒基因組編碼DNA複下作制和RNA轉錄所需的所有蛋白質紙數。因此，VACV的病毒生命周期對(duì)宿主細胞機制放農的依賴非常小。

在病毒生命周期的早期階段，會(車就huì)産生許多免疫調節蛋白，幫助病毒從宿主的病毒防禦機制用場中逃脫。成(chéng)熟的VACV主城子要有兩(liǎng)種(zhǒng)形式：在細胞去雨裂解時(shí)釋放的細胞内成(chéng)熟病毒 (IM計好V) 和通過(guò)胞吐作用釋還裡放的細胞外包膜病毒 (EEV)。這(zhè)兩(li厭電ǎng)種(zhǒng)形式都(dōu)能(néng)夠通過(gu門爸ò)病毒脂質膜與宿主細胞膜的融合來感染宿主細胞，而無需與宿主細胞表面(mià聽媽n)受體結合以進(jìn)行感染。

VACV載體的主要應用

重組VACV載體對(duì)于基老又因治療是一個富有前景的應用工具，它具有許多優點，比如良好(hǎo)的安全性、能弟喝(néng)夠容納很大的轉基因、可以感染多種(zhǒ報務ng)類型的宿主細胞、可以在增強宿主免疫反應的同時(shí動拿)避免被(bèi)宿主免疫系統靶向(xiàng)清除。

在痘病毒家族中，已經(jīng)開(kāi)發(fā著照)出具有不同感染性能(néng)和複制能(né就水ng)力的多種(zhǒng)毒株，這(zh北裡è)會(huì)影響它們在臨床應用中的實際使用。兩(liǎng)種(zhǒn書她g)非常常見的毒株是WR毒株和MV外區A毒株。雖然MVA由于其減毒特性而更常用于臨床場景，但WR的優劇多勢在于具有更高的複制效率并且可以更大程度地調節宿主答水免疫系統。這(zhè)兩(liǎng)種(zhǒng)毒株目前均被(bèi)廣工說泛用于科研和臨床研究。以下是應用了湖城VACV的一些主要研究方向(xiàng)：員門

腫瘤治療

除了直接裂解腫瘤細胞，VACV還(hái)可以通過(guò)姐笑招募免疫細胞使其分泌細胞因子來改變腫瘤微環你船境，從而引發(fā)非直接的抗腫瘤免疫反應。爲了保持VACV金現這(zhè)種(zhǒng)天靜能然的優點并增強其安全性，重組VACV進(jìn)行了特定的基因還機修飾。以Pexa-Vac溶瘤VACV爲例，其減毒特性是通過(guò內這)删除病毒TK基因實現的，并且該病毒還(hái快黑)表達GM-CSF轉基因以增強宿主免疫反應。該病毒已樂是經(jīng)用于治療多種(zhǒng)實體瘤的臨床探土和索。當前還(hái)存在其它幾種(zhǒn錯商g)溶瘤VACV的臨床試驗，可的著見VACV作爲一種(zhǒng)溶瘤治療工具正在快速發(fā)展。

疫苗制備

VACV作爲外源抗原遞送系統也相當有效。VACV可以包裝極大的從爸DNA、作爲天花疫苗具有很長(cháng)的應用曆史，這(zhè)些特性使其化鐘有利于成(chéng)爲對(duì)抗笑大多種(zhǒng)疾病的有力疫苗載體，比如針對(duì)HIV和明用狂犬病。

VACV載體的應用優勢

廣泛的組織嗜性：VACV不具有用于感染特定細胞的表面(miàn)蛋白線還，而是通過(guò)膜融合的方式感染細胞，使其可以侵入各種(zhǒng)類聽新型的包括分裂與非分裂細胞。

不整合宿主基因組：VACV的短生命周期隻有8小時(shí)，且病毒複制全程在細胞質中進笑些(jìn)行，不具有病毒基因插入宿主基因組的風黑房險。

腫瘤細胞中高複制效率：VACV在腫瘤細胞中可以選擇性地高效率複制，導緻腫還制瘤細胞裂解。

病毒複制機制獨立：VACV的mRNA轉錄極少依賴宿主細胞的組分，使其可以又開适應不同類型的宿主細胞。

宿主免疫逃避：VACV具備逃避免疫系統攻擊的能(néng技匠)力，方式包括産生補體控制蛋白結合并抑制宿主白細胞，以及利用宿主細胞的細胞膜組雪新分作爲病毒的外包膜。因此VACV可以用于不同方式的注射方法從遠端遞送至靶場窗組織或腫瘤位點。

極大的裝載量：VACV具有很大的基因組，可以容納的開嗎30 kb的外源基因。

高滴度且高感染性：VACV可以包裝産生很高的滴度，同時(s國妹hí)具有良好(hǎo)的感染性，隻需要很低的MOI即可成(ch拍師éng)功轉導。

視頻

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文檔

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