重組狂犬病毒（RABV）

運輸與存儲

我們的RABV病毒保存于HBSS緩沖液，并以幹冰形式運輸。接收到下個病毒後(hòu)，RABV可以在-80°C長(cháng)期存光低儲（可至少穩定存儲6個月），或者在-20°C存儲一周。會不RABV的保質期約爲1年。請避免反複凍融RAB木北V以避免顯著的滴度下降。

RABV制備與質量控制

RABV包裝流程如圖2所示。攜帶GOI的轉移質粒、分别攜帶RABV G、N、P、L基哥討因的包裝質粒、以及一個表達T7 RNA聚合著分酶的質粒一同轉染包裝細胞。包裝質粒表相樂達的病毒蛋白對(duì)于含有目的基因的病毒顆粒組裝是必須的。制備數影覆蓋有G糖蛋白的RABV後(hòu)，收集細胞上清，再次感染包裝細胞。此兵哥時(shí)若同時(shí)轉染一個表達異源包膜蛋白的質粒（比如表達EnvA紅媽），則可以獲得假型化的RABV病毒。對(duì)于暗少非純化的RABV病毒（體外應用級别）區去，使用超速離心法濃縮純化。對(duì)于超純化的離妹RABV病毒（體内應用級别），使用蔗糖密度梯度離心森美法濃縮純化。我們使用噬斑法檢測滴度。

圖2 典型的RABV包裝流程。

對(duì)于每一個生産的重組RAB聽舞V病毒，質量控制包括滴度檢測、無菌測試、支原體檢測等。如果RABV病毒載體表達雨如熒光蛋白，則我們會(huì)進(jìn)行熒光轉導測試。如果RABV病毒載雜冷體含有藥篩标記，我們也會(huì)在轉導中媽測試後(hòu)伴随進(jìn)行藥篩測試。此外，對(d讀暗uì)于超純化RABV，我們會(huì)進(jìn)行内理我毒素檢測。

試驗驗證

我們的RABV經(jīng)詳盡驗證可以有效轉導多種(z們們hǒng)細胞類型，包括表達TVA受體的細胞 （圖3）

圖3 表達EGFP的RABV轉導293T細胞（表達或無表達通花TVA）。轉導後(hòu)48小時(shí)使用熒光顯微鏡成(chén照們g)像。放大倍數：100×。左：明場。右：EGF商很P。

RABV背景知識

RABV是一種(zhǒng)負鏈RNA病毒，屬于彈狀病毒科。RABV基因組長劇一(cháng)度約爲12 kb，可以插入3-5 kb的轉答風基因片段。該病毒使用G糖蛋白來識别通常在神經(jīng)元軸突末端發(fā)商低現的各種(zhǒng)受體。一旦進(jìn)入軸突末端，病毒就(jiù)河美會(huì)逆行傳輸到細胞體，并在那裡(lǐ)進(jìn)行複制。RABV兒通的病毒複制和轉錄均發(fā)生在細胞質中，微信最大限度地減少了整合宿主基因組的風險，且降低了病毒生命周期對光電(duì)宿主機制的依賴。

複制後(hòu)的病毒被(bèi)随後(窗看hòu)運輸到神經(jīng)元樹突，并以出芽方公厭式釋放。這(zhè)種(zhǒng)高度嗜神經(jīn城一g)性的病毒僅能(néng)通過(算吧guò)化學(xué)突觸傳播到其他細胞，感染新的軸突末端，看費并經(jīng)由外周和中樞神經(jīng)系統繼續傳播到突觸前神經(jīn靜花g)元。

RABV載體的主要應用

神經(jīng)網絡展示

重組RABV主要用于神經(jīn喝海g)網絡的突觸追蹤（圖4）。RABV有著(zhe)逆行傳輸以及跨突觸傳播的限制，因此可實現對(文術duì)神經(jīng)連接的特定可視化銀村和調控。RABV載體通常缺失G糖蛋白基因，因此病毒在感染一級神經飛請(jīng)元後(hòu)無法傳播至其它但路細胞。 然而，當病毒被(bèi歌低)引入具有G糖蛋白表達的細胞時(shí)（比如通過(guò)AAV轉導引入）花看，可産生的功能(néng)性病毒，然後(刀笑hòu)傳播且隻能(néng)傳播至上遊二級神經(jīng)元拍說，實現單突觸追蹤。

特定神經(jīng)元中的單突觸連接研究也是一種(zhǒng)常見的實驗需謝得求。使用EnvA/TVA系統將(j訊謝iāng)允許病毒靶向(xiàng)特定神經(jīng)元：整合了Env美服A包膜蛋白的假型化RABV特異性感染同時(shí為來)表達TVA受體以及G糖蛋白的一級神經(jīng)元。這(zhè)將(jiā暗山ng)确保隻有靶細胞被(bèi)重組RABV放校感染，并允許對(duì)所有直接輸入進(jìn)行單突觸追蹤志員。

圖4 重組RABV的生産、轉導和感染。

疫苗制備

狂犬病是一種(zhǒng)出現症狀後(hòu)銀慢緻死率接近100%的疾病，其疫苗的開(kāi)發(fā)也是一個熱點問題。目個議前滅活RABV是最常用的疫苗載體形式，但是具備自我複制能(néng)力子技的重組RABV疫苗載體也在被(bèi)進黑高(jìn)一步研究。 HEP-Flury毒株因其高度減毒、低緻病微資性和較強的免疫原性而特别适合于子西該種(zhǒng)應用。

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文檔

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