突變文庫構建

技術詳情

突變文庫的構建策略

芯片合成(chéng)寡核苷酸

芯片合成(chéng)寡核苷酸的方式非常适合用于生成(chéng)的具有錯年各種(zhǒng)大小和序列的突變體，比如可在給定位點制造飽子男和突變。我們基于芯片的 DNA 合成(chéng)長(cháng)度通常可村木達300 nt，且錯誤率較低。

易錯PCR

易錯PCR是最直接用于開(kāi)發(fā)高度多樣(y讀民àng)化的突變文庫的選擇，這(zh書區è)其中包括從修改标準PCR方法到突變AAV衣殼基因等多種暗不(zhǒng)方式。更具體而言，易錯PCR結合了多種(zhǒng)內相次優化的PCR條件，如使用低保真性聚合酶、更長(cháng)的延伸時(shí)理數間、更高的Mg^₂₊濃度、添加Mn^₂₊，以及使用不相等的多種(zhǒng)dNTP濃度等方式來對(duì)畫民AAV衣殼基因引入随機突變。

簡并密碼子

密碼子簡并機制允許一個氨基酸由多個密輛國碼子編碼。通過(guò)向(xiàng)由寡核苷書術酸合成(chéng)中的簡并密碼子引入了受控的、高度随機的突變，可對(呢計duì)可能(néng)産生陽性突變腦麗的區域和氨基酸進(jìn)行針對(duì)性的靶向(xià雜長ng)。例如，廣泛使用的簡并密碼子突變文庫——NNK文庫，其NNK簡并引物涵視為蓋了32種(zhǒng)密碼子組合（N= A/C/G/T，K=場什 G/T），可以編碼所有20種(zhǒng)氨基酸和一個終止密碼呢照子。在文庫構建中利用簡并密碼子是一種(zhǒng)引入多樣(yà得討ng)性的有效方法。

DNA洗牌

DNA洗牌是一種(zhǒng)通過(guò)同源重組産生嵌合DNA序列的高對器效方法。這(zhè)項技術首先將(黃計jiāng)親本基因切割成(chéng)随機片段，然制能後(hòu)使用無引物的PCR技術并根據部分序列同源性進錢河(jìn)行重組，從而將(jiāng)它們重新組裝成了體(chéng)新的嵌合序列。另外，通外合成(chéng)洗牌將(jiāng快資)合理設計與定向(xiàng)進少笑(jìn)化相結合，可用于創建高複雜性文庫。在采用其他突變方筆從法（如易錯PCR）後(hòu)也可以進(jìn)行家族DNA洗牌。

實驗數據

圖1 質粒文庫(NNK)₁₁的核苷酸構成(chéng)

該文庫采用NNK簡并密碼子策略構建。長年每根柱子代表DNA序列中不同的核苷酸位置，顔色表示觀察到話不的核苷酸類型。所有位置都(dōu)顯示出預期的核苷酸，且校了觀察到的頻率接近理論值（N = 25% A + 2你遠5% T +25% G + 25% 看信C，K = 50% T + 50% G）。

圖2 質粒文庫7-mer可變區的氨基酸分布

該文庫利用NNK簡并密碼子策略構建而成(ché說讀ng)。每根柱子分别代表理論（綠）/實際（紅）上的特異氨基酸/終止密碼電女子的百分比。觀察到的20種(zhǒng)氨你黑基酸和終止密碼子的實際頻率與理論頻率非常接近。

圖3 雲舟生物芯片合成(chéng)的寡核苷酸文可些庫。圖示爲複雜度、覆蓋率和序列比對(duì)的一緻性。

數據以無偏向(xiàng)的方式收集于雲舟生物使用芯片合成(chéng司門)寡核苷酸文庫。（A）這(zhè)些定制文庫的大小分布高度多樣(yàn麗離g)化，複雜度從10²到超過(guò)10⁵不等。（B）覆蓋率和讀取的比對(duì)率均很高接近100%錯有，突出表明了我們文庫的極高準确性和低錯誤率。