雲舟生物的基因敲除穩轉細胞株可實現對(duì)細胞基因組靶位點的永久敲除。我海可們的基因敲除細胞采用CRISPR相關技術制備頻見，可引入單gRNA或者雙gRNA靶向(xiàng)基因組，這讀引發(fā)DNA雙鏈斷裂（DSB）。細胞對(工區duì)這(zhè)些斷裂的修複通常會(huì)導緻移碼突變或片段自友丢失，從而造成(chéng)靶基因失活。
亮點：
圖1 基因敲除細胞穩轉株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除細胞穩轉株構建（移碼突變） | 兩(liǎng)個純合單克隆細胞株（>106個細胞/管，每個克隆各2管） | ￥15,980起(qǐ) | 9-15周 |
| 基因敲除細胞穩轉株構建（缺失突變） | 一個純合單克隆細胞株（>106個細胞/管，2管） | ￥32,980起(qǐ) | 9-15周 |
* 增加交付單克隆數將(jiāng)收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲除驗證（默認） | 基因型PCR、Sanger測序 |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脫靶效應分析（額外收費） | NGS、PCR、Sanger測序 |
| 染色體分析（額外收費） | 核型分析 |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 Huh-7細胞中CRISPR介導的單gRNA基因敲除。對(duì)弟頻細胞群進(jìn)行Sanger測序，顯示CRISPR靶位點處的有視人效突變（序列痕迹分解推斷97.6%的序列包含突變）。
圖3 RNP法驗證基因敲除效率。通過(guò)gRNA-Cas9核術頻糖核蛋白（RNP）方法獲得純合敲除突變。（A你友）編輯過(guò)的RNP複合物通過(guò)電轉法導入靶細胞，分離單克窗是隆細胞并篩選。使用PCR和Sanger美機測序驗證細胞的基因型。（B）本案例在小鼠房了結腸癌細胞中進(jìn)行基因編輯。RNP通過(guò)電轉進(jìn)嗎小入細胞後(hòu)，可以結合靶基因的兩(li低些ǎng)個位點以敲除一段長(cháng)13 kbp的區域。P1明市-P4四條引物用于三個PCR反應以區分敲除和學那野生型克隆。（C）PCR結果驗證了克隆1中的純合敲除突變，并進(jì生劇n)一步在（D）靶基因測序結果中雜得得到印證。
對(duì)于CRISPR介導的基因編輯，Cas9核酸酶通過(guò)特異性的她他gRNA作用至靶位點以産生DNA遠場切割。在大多數情況下，爲了實現簡單的基因敲除在西，可以將(jiāng)單個gRNA與Cas9共同使用以産生DSB，吃聽然後(hòu)通過(guò)NHEJ進(jìn)行低效率的相要DNA修複，從而導緻序列發(fā)生城體永久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè)類突變的一部分對在會(huì)導緻基因的閱讀框移討科碼、出現提前終止密碼子等，最終導輛湖緻目的基因的功能(néng)喪失。拍風
雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶對(duì)靶位點的兩(l事間iǎng)條反向(xiàng)DNA鏈進(jìn)行切割。在媽到這(zhè)種(zhǒng)方法中，切口酶將(jiāng)在兩(liǎng)條服又鏈上産生單鏈切割，每一條鏈上的切割位點通過(guò)兩(liǎng鄉聽)條gRNA中的一條引導，然後(器輛hòu)在靶位點産生DSB。一般來說(shuō)，這(公區zhè)種(zhǒng)方法減少潛在的脫靶效應，因爲該種(zhǒng)DSB草唱的産生要求兩(liǎng)條gRNA同時(shí)靶向(xiàng)序列。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 DNA 模闆將雜業(jiāng)特定的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時(shí)，也可以使用雙坐火gRNA。在這(zhè)種(z美西hǒng)方法中，兩(liǎng)條反劇請向(xiàng)的DNA鏈將(jiāng)被(bèi)兩(liǎng離可)個gRNA靶向(xiàng)位于所需突變位點兩(liǎng)側的兩(liǎn匠文g)個位點，然後(hòu)通過(gu一笑ò)HDR途徑利用外源DNA供體模闆開哥來修複切除的序列。
爲了确定哪種(zhǒng)方法最适合您的實驗些男應用，以下是您應該考慮的一些事(shì)項。
基本原理
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過(gu南理ò)引發(fā)mRNA的切割抑制翻譯過(guò)程。shRNA敲低不改變鐵服靶基因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都(d街近ōu)是通過(guò)指導核酸酶切割基因組中的特定靶位點來發(報得fā)揮作用。然後(hòu)這(zhè)些切割位點被(bèi)細胞低效國間地修複，從而導緻修複部位的永久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺分工失。這(zhè)類突變的一部分會(huì)導緻基因女是的閱讀框移碼、出現提前終止密碼也劇子等，最終導緻目的基因的功能(néng)喪失。如果好船同時(shí)靶向(xiàng)基因組中兩(liǎng)個相鄰緊密的切割位點（一理距離幾個kb），也可以導緻其間區域的删除。
效率
shRNA敲低永遠不會(huì腦員)完全抑制靶基因的表達。即使對(duì)于最有效懂術的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會(huì)保留。相比之看來下，在一小部分經(jīng)過(gu她習ò)處理的細胞群中，CRISPR和機北TALEN可以産生永久性突變，這(zhè)可能(néng們家)導緻基因功能(néng)完全喪謝師失。
一緻性和均一性
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時(shí)獲得較好喝街(hǎo)的均一性，實驗之間的一緻性也較佳。相比放老之下，由于引入突變是随機的，C們在RISPR和TALEN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。爲了完全敲些店除細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷件她貝。鑒于正常細胞具有任何基因的兩(liǎng)個拷貝（X或Y連鎖基因除外），你煙而癌細胞可以具有兩(liǎng)個以上的拷貝，這(zhè)種(zhǒn懂線g)完全敲除的細胞可能(néng)隻占所有處理後(hòu)的細胞的從路一小部分。出于這(zhè)個原因，核酸酶介導的敲除實驗需要通過(g公商uò)測序來篩選克隆，以确定所有目的基因拷貝都(dō年門u)被(bèi)敲除的子細胞群。
脫靶效應
已有報道(dào)表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的基因敲除均會(術輛huì)産生脫靶效應。脫靶效應的表征可以通過(guò)使用多小北個不同的shRNA 靶向(xiàng)同一基因來評估。如果一個基因被(資理bèi)在多個不同的shRNA作用下仍然表現出一緻的表征，則西熱這(zhè)種(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應帶來的。對(duì)于C房近RISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能(néng)喪失突變的多個線湖克隆，以包含可能(néng)由脫靶突變引起(qǐ)的任何表資亮征。此外，可以對(duì)克隆進(jìn)行船費脫靶位點測序，通過(guò)生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否友看已發(fā)生突變。
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