雲舟生物的基因敲除穩轉細胞株可實現對(duì)細胞基因組靶位點拿司的永久敲除。我們的基因敲除細胞采用CR土就ISPR相關技術制備，可引入單gRNA或者雙gRNA靶向(xiàng)的書基因組，引發(fā)DNA雙鏈煙街斷裂（DSB）。細胞對(duì)這(zh師議è)些斷裂的修複通常會(huì)導緻移碼突變或片段丢失，從而造成(chén媽紅g)靶基因失活。
亮點：
圖1 基因敲除細胞穩轉株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除細胞穩轉株構建（移碼突變） | 兩(liǎng)個純合單克隆細胞作小株（>106個細胞/管，每個克隆各2管） | ￥15,980起(qǐ) | 9-15周 |
| 基因敲除細胞穩轉株構建（缺失突變） | 一個純合單克隆細胞株（>106個細胞/管，2管） | ￥32,980起(qǐ) | 9-15周 |
* 增加交付單克隆數將(jiāng)收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲除驗證（默認） | 基因型PCR、Sanger測序 |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS雪我 |
| 脫靶效應分析（額外收費） | NGS、PCR、Sanger測序 |
| 染色體分析（額外收費） | 核型分析 |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 Huh-7細胞中CRISPR介導的單gRNA基因敲除。對近還(duì)細胞群進(jìn)行Sanger測線兒序，顯示CRISPR靶位點處的有效突變（序列痕迹分解推斷97.6%南相的序列包含突變）。
圖3 RNP法驗證基因敲除效率。通過(guò)gRNA-Cas9核糖核市技蛋白（RNP）方法獲得純合敲除突變。唱都（A）編輯過(guò)的RNP複合物通過(guò)電轉法導入靶細胞，分離單克公醫隆細胞并篩選。使用PCR和Sanger測序驗證細胞的基因型。（B）本案例在小鼠月場結腸癌細胞中進(jìn)行基因編輯。RNP通過(guò)電轉在都進(jìn)入細胞後(hòu)，可以結合靶基因的兩(liǎng)個位點光務以敲除一段長(cháng)13 kbp的數弟區域。P1-P4四條引物用于三個PCR反應以區分敲除和野生明拿型克隆。（C）PCR結果驗證了克隆1中的純合敲除突變，并進(j什地ìn)一步在（D）靶基因測序結術公果中得到印證。
對(duì)于CRISPR介導的基因編輯，Cas9核酸酶通過(guò)特異性的著劇gRNA作用至靶位點以産生DNA切割。在大多數情況醫謝下，爲了實現簡單的基因敲除，可以將(jiāng)單個gRNA能會與Cas9共同使用以産生DSB，然後相時(hòu)通過(guò)NHE草我J進(jìn)行低效率的DNA修複，從而導緻序列發(fā)生永久性突變，比如産麗北生基因的小片段插入或堿基缺失。這(動新zhè)類突變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼裡不、出現提前終止密碼子等，最終導緻目的基因的功能(néng)喪失。
雙gRNA則一般用于結合Cas9(D10A)切口酶市討對(duì)靶位點的兩(liǎng)條反向(xiàng)DNA湖高鏈進(jìn)行切割。在這(zhè)種(zhǒng)方法中，算從切口酶將(jiāng)在兩(liǎng)條鏈上産生單鏈切割，每一條鏈謝樂上的切割位點通過(guò)兩(liǎng)條gRNA中的一條引導，然後(h和身òu)在靶位點産生DSB。一般來說(shuō)，這(zhè)種(zhǒn鐘不g)方法減少潛在的脫靶效應，因爲該種(z技家hǒng)DSB的産生要求兩(liǎng)條g放器RNA同時(shí)靶向(xiàng)序列。
當使用Cas9(D10A)切口酶和外源供體 DNA 模闆將(j讀術iāng)特定的堿基（例如敲入）引入感興趣的基因時(shí)，也話木可以使用雙gRNA。在這(zhè)種(zhǒng)方件明法中，兩(liǎng)條反向(xiàng)的DNA鏈將(jiān兒水g)被(bèi)兩(liǎng)個gRNA靶向(xiàng)位于所需突報視變位點兩(liǎng)側的兩(liǎng)個位點，然後(h著員òu)通過(guò)HDR途徑利用外源長森DNA供體模闆來修複切除的序列。
爲了确定哪種(zhǒng)方法最适合您的實驗應聽舞用，以下是您應該考慮的一些事(sh嗎電ì)項。
基本原理
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRN開下A，通過(guò)引發(fā)mRNA的切話從割抑制翻譯過(guò)程。shRNA敲低不改變靶基紙林因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都(dōu)是通過(guò)指導核酸酶切割基因組中的特低雨定靶位點來發(fā)揮作用。然後(hòu)這(zhè)些切割西劇位點被(bèi)細胞低效地修複，從而導緻修複部位照自的永久性突變，比如産生基因的小片段插入或堿基缺失。這(zhè來化)類突變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼、出現提北醫前終止密碼子等，最終導緻目的基因的功能(néng微離)喪失。如果同時(shí)靶向(xiàng)年近基因組中兩(liǎng)個相鄰緊密的切割位點（距離幾個kb），也可以導緻其間森討區域的删除。
效率
shRNA敲低永遠不會(huì)完全抑制靶基因的表達。即使對(duì)于最有市內效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會(些謝huì)保留。相比之下，在一小部分經(jīng)過場綠(guò)處理的細胞群中，CRISPR和TALEN可謝科以産生永久性突變，這(zhè)可能(néng)導緻基因功能(néng)完全答拿喪失。
一緻性和均一性
shRNA載體通常在轉染/轉導的細胞時(shí技答)獲得較好(hǎo)的均一性，實驗之間的一緻性也較佳。相比之下跳理，由于引入突變是随機的，CRISPR和TALEN的基因編業你輯效果在細胞之間的差異相當大。爲了完全敲除遠林細胞中的目的基因，必須敲除細胞中內高基因的所有拷貝。鑒于正常細胞具有任何基視畫因的兩(liǎng)個拷貝（X樂關或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有兩(liǎng去鐵)個以上的拷貝，這(zhè)種(zhǒng)完全敲除的細胞可請匠能(néng)隻占所有處理後(hòu)近計的細胞的一小部分。出于這(zhè)個原因，核酸酶兵妹介導的敲除實驗需要通過(guò)測序來篩選克隆，以确定所有目的基因拷貝都(這科dōu)被(bèi)敲除的子細胞群。
脫靶效應
已有報道(dào)表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的歌吃基因敲除均會(huì)産生脫靶效應湖村。脫靶效應的表征可以通過(guò)使用多個不同山那的shRNA 靶向(xiàng)同一基因來評估。如果一個基因被(bèi)在多個上區不同的shRNA作用下仍然表現出一緻的表征，則這(zhè相南)種(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應帶來的。對(du外窗ì)于CRISPR或TALEN基因敲除，應開長分析含有功能(néng)喪失突變的多個克隆，以包含可能(néng)由脫靶答書突變引起(qǐ)的任何表征。此外，可以對(duì)克隆個道進(jìn)行脫靶位點測序，通過(g資雪uò)生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否已新技發(fā)生突變。
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