雲舟生物的基因敲入穩轉細胞株可實現對(duì妹林)細胞基因組靶位點的永久敲入。我們的基因敲入細胞采用CRI還內SPR相關技術制備，需要針對(duì)轉導細胞的靶位點導入一個特異性的gR員道NA/Cas9 RNP複合物，以及一個可通過(guò)HDR修複方式引入供高高體序列的供體載體。我們擁有一系列獨特的技術，現鐵可讓我們在很短的周期内實現具有高HDR率的高效基因遞送，高成(chén鐘道g)功率獲得敲入純合子。
亮點：
圖1 基因敲入穩轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲入細胞穩轉株構建（插入片段<3 術亮kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥42,980起(qǐ) | 14-20周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株（>兒歌;106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
| 基因敲入細胞穩轉株構建（插入片段>3 kb） | 一個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 2管） | ￥69,980起(qǐ) | 18-25周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株（>106個細胞/管, 每個克隆各2管） | 請咨詢 | ||
* 增加交付單克隆數將(jiāng討黑)收取額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲入驗證（默認） | 基因型PCR、Sanger測序 |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脫靶效應分析（額外收費） | NGS、PCR、Sanger測序 |
| 染色體分析（額外收費） | 核型分析 |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 CRISPR介導的iPSC基因敲入。通過(guò)電轉法向科得(xiàng)iPSC中導入Cas9/gRNA R的窗NP複合物和供體載體，成(chéng)功敲入UBC驅動表達的EGFP（2討吃432 bp）。（A）Sanger測序确認EGFP成(chéng)功敲為分入靶位點。（B）基因型PCR分析四個敲入純合子的單克隆。野生型（WT）靶聽得點的長(cháng)度爲762 bp，敲鐘嗎入了EGFP的靶點的長(cháng)度爲319學購4 bp。（C）顯微鏡下的成(chéng)功敲入的細胞具有EGFP熒光鐘答。（D）核型分析結果。（E）EGFP敲入的iPSC中多能(néng)刀呢性标記物（NANOG、OCT4和要的SOX2）的免疫熒光結果。
基因敲除依賴于非同源末端連接 (NHEJ) 介導的 CRIS秒師PR 引起(qǐ)的DNA雙鏈斷裂 (DSB) 修複著船，該機制容易出錯，移碼或片段删除（使用雙 gRNA 時(shí)）等突為司變會(huì)以一定頻率發(fā)生，導緻目标基因功能(néng)喪失。另南鐵一方面(miàn)，基因敲入則依賴于同源定向(xiàng)修複（H商又DR）機制，可將(jiāng)供體片段精确插入靶位點，其員短效率比NHEJ低，且僅限用于分裂細胞。此外，HDR效率也因細胞類型了報而異。因此，基因敲入在技術上比基因敲除更具挑戰性。
選擇供體模闆的首要考慮因素是您的模闆大小。對(duì)于小片段插中機入（<10 kb）,ssODN通常是最佳的選擇，其視哥HDR效率較高。對(duì)于大片段，可因情況選擇使用日資線性dsDNA（細胞毒性較高，HDR率高）或者環狀質粒載體（細胞耐受性好(hǎ紅花o)，HDR率低）。
藥篩後(hòu)獲得陽性轉導的混合細胞群。采用血細胞吧暗計數闆等工具确定細胞數量和濃度。對(duì)細胞進(jìn)行梯度稀請男釋，然後(hòu)在96孔闆中培養，并使其濃度爲<1 細胞/孔。單獨的細技鐘胞克隆將(jiāng)被(bèi)分離并擴增，對(du校秒ì)其進(jìn)行基因型鑒定。
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