雲舟生物可以爲您的目的基因構建敲低效果長(cháng)效的細胞穩快我轉株。爲保證敲低效率，每個細胞株獨自接受來自3個shRNA慢病毒媽睡中的一個的病毒轉導。經(jīng離這)過(guò)RT-qPCR驗證，我們很友交付敲低效率最佳的細胞株。此外她靜，每批細胞産品放行前，我們還(hái)會(huì)東河開(kāi)展一系列QC試驗，比如無看唱菌測試、支原體檢測等。
亮點：
圖1 基因敲低穩轉細胞株的構建流程。
| 服務 | 交付内容 | 價格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低細胞穩轉株構建 | 多克隆細胞群（>106個細胞/管，2管） | ￥18,980起(qǐ)&nbs雨明p; | 8-13周 |
| 兩(liǎng)個單克隆細胞株校和（>106個細胞/管，每個克隆各2管） | ￥23,980起(qǐ) | 13-18周 |
* 增加交付單克隆數將(jiāng)收取音金額外費用。
| 試驗項目 | 方法 |
| 基因敲低驗證（默認） | RT-qPCR |
| 表達測試（額外收費） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 無菌測試（默認） | PCR檢測支原體、生物負荷檢測等 |
圖2 在Hep-G2細胞中高效敲低D下高NAJC12基因。（A）攜帶EGFP的DNAJC12 shRNA慢病毒轉空金導Hep-G2。（B）RT-qPCR檢測基因敲低效率達90.9白頻%。三次重複試驗；p value&妹兵lt;0.001。
我們設計和評估shRNA的規則與RNAi c學這onsortium（TRC）使用的規則類似。對(duì)于每子訊個RefSeq轉錄本，我們會(huì)搜索出所有的2什物1 mers作爲候選靶位點。以下因素會(huì)降低幹擾效率/特異性東爸或影響克隆，含有這(zhè)些特點的序列將(jiāng)會(huì)被房站(bèi)排除。主要因素包括：含有≥4個連續相同堿基，含有≥7個G或C，GC含到鐵量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA堿技熱基。如果靶點内部含有莖環結構，或是3'末端的G得來C含量較高，或是該靶點是已知的miRNA核心序列或是會(huì)打靶雨大到其他基因，則該靶點的分值就(j小服iù)會(huì)較低。若靶位點存在于一個基因的多個綠家轉錄本，則該靶點的分值就(jiù)會(hu短看ì)較高。 所有的幹擾分值均≥0，平均數約爲會放5，标準差約爲5，95%的分值均≤15。若一個shRNA的幹擾分值是15公去，則表示具有很高幹擾效率且易于克隆；若幹擾分值爲0，則表示幹讀哥擾效果較差或難以克隆。
爲了确定哪種(zhǒng)方法最适合您的實驗應用，以下是您應該化吧考慮的一些事(shì)項。
基本原理
基因敲低載體表達shRNA抑制靶基因的mRNA，通過東從(guò)引發(fā)mRNA的切割抑制翻師信譯過(guò)程。shRNA敲低不改變靶基因的DN她司A序列。
CRISPR和TALEN都(dōu)是通過(guò)指導核酸酶切割基因組中的特拍機定靶位點來發(fā)揮作用。然後(hò能國u)這(zhè)些切割位點被(bèi)細胞低效地修複，從而導緻修複部位的永暗紅久性突變，比如産生基因的小片段插費月入或堿基缺失。這(zhè)類突變的一部分會(huì)導緻基因的閱讀框移碼、出鐵著現提前終止密碼子等，最終導緻目的基因的功能(néng)喪失。如很歌果同時(shí)靶向(xiàng)基因組中兩(liǎng)個相鄰緊密的機城切割位點（距離幾個kb），也可以導緻其間區域的删除。
效率
shRNA敲低永遠不會(huì)完全抑制靶基因的表達。即使對(duì)于對刀最有效的shRNA，靶基因的一些殘留表達也會(huì)保留。日我相比之下，在一小部分經(jīng)過(媽呢guò)處理的細胞群中，CRISPR和TALEN路舊可以産生永久性突變，這(zhè)可能(néng)導緻基因功短低能(néng)完全喪失。
一緻性和均一性
shRNA載體通常在轉染/轉導的細他習胞時(shí)獲得較好(hǎo)的均一性近公，實驗之間的一緻性也較佳。相比之下，由于引入突變是随機的，CRISPR和TAL筆算EN的基因編輯效果在細胞之間的差異相當大。爲了完全敲除話秒細胞中的目的基因，必須敲除細胞中基因的所有拷貝。鑒于正看街常細胞具有任何基因的兩(liǎng友對)個拷貝（X或Y連鎖基因除外），而癌細胞可以具有理厭兩(liǎng)個以上的拷貝，這(zhè)種(zhǒn海綠g)完全敲除的細胞可能(néng)隻占所有處理後(hò數花u)的細胞的一小部分。出于這(zhè)個原因，核姐南酸酶介導的敲除實驗需要通過(guò)測序來篩選克隆，以确定所有目的基因動冷拷貝都(dōu)被(bèi)敲除的子細胞群。
脫靶效應
已有報道(dào)表明shRNA介導的基因敲低和核酸酶介導的件又基因敲除均會(huì)産生脫靶效應。脫靶照窗效應的表征可以通過(guò)使用多個不同的shRNA 靶向(雨喝xiàng)同一基因來評估。如果一個基因被(bèi)資暗在多個不同的shRNA作用下仍然表現出一緻的表征，則這(zhè)種道媽(zhǒng)表征通常則不是脫靶效應帶來的。對(du做秒ì)于CRISPR或TALEN基因敲除，應分析含有功能(né服樂ng)喪失突變的多個克隆，以包含可能(néng)由脫靶突技河變引起(qǐ)的任何表征。此外，可以對(du這裡ì)克隆進(jìn)行脫靶位點測序，通過(g兒見uò)生物信息學(xué)方法鑒定以查看它們是否已發(fā)生突變。
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