雲舟生物的barcode文庫可幫助研究內唱人員在實驗中對(duì)單分子或細胞水平的變化進(jì通個n)行複合分析。Barcode文庫可以以E. coli菌株、DNA或者技年病毒的形式交付。我們定制的文庫都(dōu)會(huì)習師進(jìn)行NGS測序驗證以确定文庫工員的複雜度、均一性和無偏向(xiàng)性。
亮點
表1 文庫構建服務價格與周期
| 服務 | 簡述 | 價格（CNY） | 周期 |
|---|---|---|---|
| 文庫設計 | 設計barcode序列和載體骨架行吃、制定barcode合成(ch空草éng)策略以及文庫克隆策略，使複雜度大于醫問108，可穩定且高通量地應用于基因功美中能(néng)研究。 | 免費 | 1-4 天 |
| 文庫質粒克隆（包括oligo合成(chéng)和N高答GS驗證） | 見表 2。 | ||
| 文庫的病毒包裝 | 點擊此處了解更多病毒包裝服務信息。文庫質粒的病毒病毒答不包裝價格是常規單質粒載體包裝的1.5倍。 | ||
| 功能(néng)篩選樣(yàng)品的NGS測序分析 | 包括細胞樣(yàng)品基因組的NGS文庫制備、ll弟個umina測序（> 500x覆蓋率）和數據分析。 | ￥ 2,240/樣(yàng)本 | 3-5 周 |
表2 文庫複雜度與文庫載體克隆價格
| 文庫複雜度 | 價格（CNY） | 周期 | |
|---|---|---|---|
| <106 | 19,600起(qǐ) | 5-8 周 | |
| 106 ~ 107 | 28,000起(qǐ) | 5-8 周 | |
| 107 ~ 108 | 45,500起(qǐ) | 8-11 周 | |
| >108 | 請咨詢 | ||
使用核苷酸創建barcode 涉及爲好文不同的信息分配獨特的DNA序列。首先，可以使用一個短的核苷酸序列編碼基礎信息，西員例如一個特定細胞的标識符。具體而言，“ATCG”可能(néng)代表細胞1，外聽“TAGC”代表細胞2。随著(zhe)barcode長(cháng)間票度的增加，編碼信息的複雜性和多資少樣(yàng)性會(huì)呈指數級增長(cháng)們線。Barcode的長(cháng)度越長(c西明háng)，可用的排列組合數量越多，其識别更多變體的能(néng)力也越強。河還
Barcode 文庫的最大複雜度可以根據給定的一組核苷著自酸其生成(chéng)的排列組合數目計算。對(duì)于随機核苷酸的barco的跳de ，每個位置可能(néng)有四種(zhǒng)結果：A、T、G分爸或C。給定barcode長(cháng)度（N）的票報排列組合總數（複雜度）爲4N。例如：一個随機NNN barcode 有64種(zhǒ體技ng)（43）可能(néng)的組合。随著(zhe)b事亮arcode長(cháng)度的什影增加，複雜度呈指數級增長(cháng)飛草。這(zhè)種(zhǒng)指數增長(c木弟háng)彰顯了barcode文庫可使用作拿更長(cháng)的序列來編碼信息的能(néng)力行在，因爲它允許barcode中擁有數量衆多的唯一标識符。
設計病毒載體中barcode的位置需要策略性的考量，以确保讀取計數的有效性以及報電與文庫克隆、篩選和去卷積分析過(guò)程的兼容性。藍冷對(duì)于慢病毒載體，barcode應位于到病錯員毒載體的整合區域中，确保它與相關遺傳元件（如gRNA或可變區域）愛綠一起(qǐ)穩定整合到宿主基因組中。如果將(jiāng)barcode玩農定位在轉錄區域内，將(jiāng)可通過(guò)車北RNA轉錄物進(jìn)行barcode讀取。爲了方便後(h電化òu)續分析，所選barcode序列應兼容PCR，以對妹便有效且均勻地擴增。此外，barcode設計應适用于N輛西GS，确保在測序過(guò)程中可檢測和準确量化。理想情況下，barcode序章草列不應幹擾所研究的生物過(guò)程，以避免結現和果出現人工假象，但這(zhè)通常要求充備的見討先驗知識以進(jìn)行判斷。
設計barcode還(hái)需要腦高考慮所謂一對(duì)一或多對(duì)一策略。Barcode和問湖可變區之間的一對(duì)一關系意味著(z聽廠he)單個barcode僅代表一場林個可變區，這(zhè)确保了bar門小code與其各自的可變區之間直接關聯。而在多對(du站技ì)一關系中，多個barcode可以代表相同的可變區。業術這(zhè)種(zhǒng)策略具有特别的優勢：首先，將(jiāng)表示相同志事可變區的多個barcode視爲重複樣(yàng)本讀一，從而增強了陽性結果的可統計性。這(zhè)種工分(zhǒng)統計數據量的提升有利于識别真正的陽性結果藍煙并將(jiāng)其與高通量實驗中産生的随機變化相區分。其次，爲同一可變區多那使用多個barcode可以進(jìn)行克隆分析，這(zhè)對(duì厭農)于研究異質性細胞群（如腫瘤細胞）也有重要的價值。
爲了將(jiāng)DNA barcode慢拿遞送到細胞中，研究人員可以使用病毒載體如慢熱筆病毒、AAV和逆轉錄病毒系統，或者非病毒載體如pi要公ggyBac和Sleeping Beauty的轉座子系統。特别科厭是在NGS分析時(shí)，分離細胞要要的barcode需要确定使用RNA還(hái)是基因頻聽組DNA用作barcode讀取，而這(zhè)是由了船將(jiāng)barcode引入細胞的基因遞送系統類要媽型決定的。將(jiāng)barcode永久性森謝地整合到細胞基因組中的系統有利于基因組DNA的分離。然而，這(z畫藍hè)還(hái)需要确保它們适合于PCR擴增并與NGS測序兼容。另一方面(下光miàn)，如果barcode作爲轉錄本的一部分表達，RN雨錢A則反映了barcode的讀取信号。在單細胞RNA測序實雜子驗中，如Perturb-Seq和CROP-Seq，需要同時(shí)捕獲會笑轉錄本和barcode信息，R業到NA讀取對(duì)于實驗設計的兼容性至關重要。總而愛關言之，barcode讀取策略的選擇與barcode遞送系統的既定知如特征以及實驗目标是密切關聯的，而這(zhè)也印證了高度定制化的實驗方法知雪對(duì)于相對(duì)獨特的研究的重要性。
圖1 一個N(21)barcode的核苷酸分布，使歌海用簡并核苷酸策略顯示每個位置的A、C、G、T的百分比信喝。該圖表明在所有位置的核苷酸比例分布相近。
Delivery system: Selection of an appropri拿這ate delivery system, such花兵 as lentivirus, re紙快trovirus, AAV, or transposo土到n systems, based on 什他the target cell可生s and experimental requirements. 個白Different systems may affect the西歌 integration and stability of 火家barcodes in the cellul校為ar genome.
Length of barcode: Determining the optimal length of the b技可arcode is crucial.懂吧 Considerations include the scre制明ening scale and th朋街e theoretical maximum c著銀omplexity of the barcode librar土厭y. Longer barcodes allow花校 for higher complexity but may pose cha短黃llenges in synthesis 玩個and readout.
1-to-1 or multiple-to-對都1 correlation: Deciding whether數大 each barcode corresponds to光訊 a single variable開件 region (1-to-1 correlation) or 通多if multiple barcodes 裡你can represent a single variab裡坐le region. This紙電 choice impacts the resolution, s好子pecificity, and statistical power o答的f a given library in capturin小技g information.
Barcode sequence design: Choosing the barcode s又藍equence design strategy, which may invo也理lve predesigned sequences or random b影愛arcode structure (fixed or random)知男. The design affects the synthes作農is of barcodes and the overall c風相loning strategy employed i通高n library construction.
Placement of barcode: Carefully considering t了得he placement of barcodes within 動通the genome or transcriptome b請白ased on the desired readout method. Th空美is includes ensuri報內ng compatibility with clo做又ning strategies and accounting for the紙又 downstream readout technique, w文數hether it involves sequencing genom女新ic DNA or transcriptomic RNA.
圖 2. 一個barcode實驗的流程案例
With viral vector delivery,看土 cell lines of interest a為懂re transduced wi對請th the barcoding librar長慢ies at a low mul腦算tiplicity of infection (MOI) to l水購abel each cell with a uniq新低ue barcode. The barcoded cell pop身就ulation is then subject林地ed to selective pressure又歌 until clonal populations海南 emerge. The harvested resistant 鐘妹clones are pooled, and barcode s章行equences are PCR-a紙月mplified from genomic DNA or i國開solated from transcripts encoding問視 the barcode infor農女mation for NGS. The 歌跳NGS data provides a quantitative readou和我t of the number of clones in th在畫e population and the relative abundance街河 of each clone.
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