慢病毒體内應用

背景

在過(guò)去的幾十年間，HIV-1依賴的公匠有缺陷的慢病毒已經(jīng)成(chéng)爲目前應用最廣泛的基因轉快技移載體之一。慢病毒是一種(zhǒng)含有二倍體正鏈RNA基因組畫煙的包膜病毒。一經(jīng)感染宿主細胞，該病化空毒即利用反轉錄酶將(jiāng)其RNA轉錄校呢成(chéng)雙鏈DNA，随後(hòu)永中從久的整合到宿主細胞的染色體中。

修飾後(hòu)的慢病毒已被(bèi)工也移除所有的病毒結構基因，僅保留LTR序列和包裝信号樹著以用于導入治療基因，仍然具有細胞感染能(néng)力。分明不過(guò)産生新的病毒顆粒所需的病毒基因不複存在。爲提高病毒安全性志村，轉移載體3’LTR也存在缺失，保畫志證病毒整合後(hòu)仍保持“自身滅活”湖時（SIN）。

重組慢病毒最具優勢的特征在于能(好吧néng)夠有效調控基因物質在分裂細胞和不分裂細下又胞中的轉導、整合以及長(cháng)期表多科達。先導整合複核體（PIC）能(néng)夠允許慢病毒通過(藍笑guò)核孔複合體（NPC）來跨越核膜，提升慢病毒感染非分裂細胞的能(n問學éng)力。其他大多數的反轉錄病毒則需要在有絲分裂期核孔破裂時(shí)笑也達到宿主的核染色質。由于大多數的細胞類型在體内水工被(bèi)認爲是靜止的，因此重組弟笑慢病毒成(chéng)爲了許多體内應用的選擇。再者，與腺病毒不同的是，慢用熱病毒在體内不具有免疫原性。

CD4是與自然的HIV包膜糖蛋白結合的主要受體，因此慢病毒載體的靶向(xi玩報àng)性十分受限。CD4受體僅僅位于免疫細胞的表面(miàn)。吃舊爲感染不表達CD4的細胞，載體通過(guò)水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV近新-G）假病毒化，VSV-G作爲一種(zhǒng)窗說棒狀病毒包膜蛋白能(néng)夠與下地細胞質膜表面(miàn)廣泛存在的磷脂答舊組分而不是某些特異細胞表面(miàn)見唱受體相結合。這(zhè)類病毒均具有廣泛的宿主細胞範圍，包含神經(jī都在ng)元細胞、淋巴細胞以及巨噬細胞等細胞類型。而制科之前，反轉錄病毒是不能(néng)被(bèi)用于這(zhè)些細胞類型的。低高再者，慢病毒載體已被(bèi)證明能(néng)在體内有機有效轉導腦、肝髒、肌肉以及視網膜。

一個慢病毒顆粒通過(guò)細胞表面(miàn)結合進(jìn)入宿主細胞。是近釋放病毒RNA基因組并反轉錄合成(chéng)DNA。随後(hòu)D為習NA通過(guò)病毒整合酶随機整合到宿主基因組門機中。

圖1. 慢病毒轉導機制的簡要示意圖

交付内容

下表爲定制化慢病毒産品的交付内容。可在相應COA（Cer西機tificate of analysis d舞吃ocument）文件查看病毒滴度。

産品類型	交付内容	産品規格	應用範圍
小規格包裝	定制病毒	濃縮病毒（>10⁸ TU/ml, 10×25 µl, HBSS保上到存液）	體外培養細胞
	對(duì)照病毒	濃縮病毒（>10⁸ TU/ml, 1×100 µl,站身 HBSS保存液）	體外培養細胞
	Polybrene	5 mg/ml，溶于無菌去離⼦⽔，2知東00 µl	——
中規格包裝	定制病毒	超純化病毒（>10⁸ TU/ml, 10×100 &學車micro;l, HBSS保存液）	體外培養細胞
	對(duì)照病毒	超純化病毒（>10⁸ TU/ml, 2×100 &micr鄉拍o;l, HBSS保存液）	體外培養細胞
	Polybrene	5 mg/ml，溶于無菌去離⼦⽔，200 &mi如喝cro;l	——
大規格包裝	定制病毒	濃縮病毒（>10⁹ TU/ml, 10×100 µ西村;l, HBSS保存液）	體外培養細胞
	對(duì)照病毒	濃縮病毒（>10⁸ TU/ml, 2×100 &冷電micro;l, HBSS保存液）	體外培養細胞
	Polybrene	5 mg/ml，溶于無菌去離子水, 200 &micr請快o;l	——
中規格包裝和超純化	定制病毒	超純化病毒（>10⁹ TU/ml, 10×50 µl, HBSS保存液要年）	動物體内
	對(duì)照病毒	超純化病毒（>10⁹ TU/ml, 10×50 &mi森些cro;l, HBSS保存液）（選購）	動物體内
	Polybrene	5 mg/ml，溶于無菌去離子水，200 µ畫商l	——
大規格包裝和超純化	定制病毒	超純化病毒（>10⁹ TU/ml, 10×100 µl, HBS化我S保存液）	動物體内
	對(duì)照病毒	超純化病毒（>10⁹ TU/ml, 10×100 科林µl, HBSS保存下裡液）（選購）	動物體内
	Polybrene	5 mg/ml，溶于無菌去離子水，20媽亮0 µl	——

* 表格所示産品規格适用範圍爲一般慢病毒好呢載體。

若病毒被(bèi)用于體外細胞培養務很，則無需進(jìn)行超純化處理。若被(bèi)用于體快明内研究（即動物研究），則必須進(jìn)行超純化處低湖理以去除有缺陷的病毒顆粒、細胞碎片以及少多廠量的培養基，這(zhè)些污染物會(huì)引起(qǐ)強烈的免疫反應。此外計紅，超純化可將(jiāng)病毒濃縮到體内注射的适宜濃度。廠弟

接收病毒後(hòu)的處理

1. 慢病毒産品使用幹冰冷藏運輸。收到病毒後(hòu)，可直接放置-80樹一°C冷凍保存至少6個月，也可放置-通遠20°C冷凍保存一周。將開低(jiāng)Polybrene聽明放置-20°C冷凍保存，也可放置4°C時制保存兩(liǎng)周。

2. 使用前，將(jiāng)病毒液放置冰上進銀和(jìn)行融解。實驗過(gu知見ò)程中，亦需保持冰上放置。慢病毒在高溫條件下懂錯失活較快。

3. 若實際用量較少，可將(jiāng)文東融解的慢病毒小量分裝多管，再放置-80°C冷凍保存。但需要注意技民的是，每一次凍融都(dōu)會(huì)導緻滴路快度下降（約20%）。

注意：應避免反複凍融，以免造成(chéng)滴度大幅降低。

安全須知

所有VectorBuilder的慢病毒載體均是自我失日麗活型，這(zhè)意味著(zhe)被(bèi)感染的細胞不能(néng)慢對複制出新的病毒顆粒。這(zhè)是由于病毒中的基因化數組缺失了病毒複制相關基因導緻的。盡管如此，慢病毒本身具有轉刀人導人原代細胞的能(néng)力，理論上仍有生物危錢線險的風險。我們建議按照BSL-2規範（Biosafety Level-2要相，二級生物安全防護水平）對(duì)慢病毒進(jìn)行操作。所有的操作、儲存通書以及生物廢料的處理均需依照公共發(的歌fā)布的和所處機構制定的規範條例。

齧齒動物大腦定點注射方案

示蹤物或者工程化病毒在齧齒動物腦内的注射，通過購學(guò)靶向(xiàng)大腦特定局域顯著增強了我們對(duì)神經(jī還說ng)系統的理解。這(zhè)些技術目前已被(什間bèi)普遍應用于神經(jīng)系統科學(x票學ué)。計劃使用慢病毒進(jìn)民去行腦内注射時(shí)，需要考慮的一個重讀看要方面(miàn)是病毒顆粒在大腦包外細胞空間拍年（ECS）中的擴散程度。脊椎動物中樞神經(討內jīng)系統細胞間的ECS被(bèi)估測＜40森很 nm。AAV病毒直徑約爲20 nm，與之不同的是，慢病毒顆粒就書則要大的多（直徑接近100 nm），顆粒大小可能(nén工用g)極大的限制了它們在大腦中的自由擴散。爲判斷研究中呢件最适的注射量，您需要使用報告慢病毒（如表達EGFP的慢病少多毒）在實驗動物中進(jìn)行預實驗。

材料

1. 試劑

超純化慢病毒（推薦病毒滴度爲＞1×10⁹ 個感染顆粒/ml）
小鼠或者大鼠
消毒劑（70%乙醇）
麻醉劑和止痛劑（例如氯胺酮等）
潤滑劑眼藥膏
PBS
骨蠟

2. 設備

電動剃須刀
外科手術工具，包括小外科手術刀和剪刀，精細鉗裡有子和手術鈎
小動物腦立體定位儀
解剖顯微鏡
棉簽
帶小型牙鑽的手持鑽機
10 ul注射器＋33 guage針頭
10 ul注射器＋27 guage針頭
手術縫合線
可溫控鼠籠
電熱毯

操作流程

1. 麻醉

給動物稱重，确定所用麻醉劑劑量海件。例如氯胺酮-甲苯噻嗪混合物，成(chéng)年小鼠歌公以及大鼠用量通常爲每千克體重80~10mg氯胺酮你拿和10 mg甲苯噻嗪。
通常使用腹腔注射法麻醉動物。
將(jiāng)實驗動物放置在電熱毯上以維持體溫穩水我定。
實驗動物需在10分鍾内進(jìn)入深度麻醉。通過(g雜外uò)夾鼠尾方法檢測動物對(duì)刺激的反應高從以确定麻醉深度。

2. 動物準備

刮掉頭蓋骨上的毛發(fā)
用70%乙醇擦拭皮膚
手術中使用潤眼膏避免角膜炎
用鑷子拔出舌頭以促進(jìn)呼吸

3. 動物固定

爲將(jiāng)動物固定在腦立體定位儀中請在，在腦立體定位儀上安裝一個耳棒，溫柔地牽引動物頭部以將(jiāng從器)其耳道(dào)放在耳棒之上，保持動物的頭部位置，友內随後(hòu)緩慢放置好(hǎo)第二根耳棒以完成(chéng)固定。能街
緩慢地將(jiāng)門牙适配器放入動物嘴裡(lǐ)，直到動物的門牙被(bè友空i)嵌入适配器開(kāi)孔中，舊影之後(hòu)輕柔的將(jiā書東ng)适配器拉回并固定到位。
鼻夾是動物的最後(hòu)一個固定點，需要美司輕壓在動物鼻子上。

圖2. 動物固定示意圖

4. 開(kāi)顱手術

用一把小手術刀或者手術剪在動物中線位置做切口。分離皮膚和肌肉組織并用小看算的手術鈎將(jiāng)該部位撐開(kāi)。
用棉簽清理頭蓋骨表面(miàn)直到前鹵和λ區清晰可見。
用門牙适配器的螺釘調整動物頭部位置，以保章書證動物頭骨前端處于水平。
采用立體定位法，沿著(zhe)三個軸向(xiàng)，到風分别從注射器前端開(kāi)始直到前囪點。标記下坐标軸，該點即爲子土三個坐标軸的零點。
壓低注射器尖端直至其接觸到頭蓋骨，用記号筆做好(hǎo)标記。移都費走注射器以免造成(chéng)損傷。
利用手持鑽機，采用輕微的下壓方式，削鄉紅薄頭蓋骨靶位點區域（一個注射位點約1 mm&time靜亮s;1 mm）。在打磨過(gu信綠ò)程中，我們通常會(huì)使用40倍解剖顯微鏡匠花。當頭骨很薄時(shí)則停止打磨（此時(shí)腦膜血管清晰可見）綠街。
用一個小針頭（27 guage）仔細電做地在手術切口邊緣穿孔。之後(hòu)，用針頭尖端將(jiāng)變薄的頭骨嗎化翻開(kāi)後(hòu)用精細的鑷子小心取出可一。用于注射的針頭能(néng)夠輕易的插入小鼠以及年輕大雪習鼠的頭骨的硬腦膜中，因此無需把硬腦膜打開(kāi)。
用PBS保持暴露出的頭骨和硬腦膜濕潤。

圖3. 小鼠頭骨立體定位

5. 慢病毒注射

吸取所需體積（一般4 ul）的慢病毒溶液。
將(jiāng)注射器放置在洞口上方，緩慢地垂直下可刀移注射器直至觸到頭蓋骨表面(miàn)。繼續降低注射器制其穿過(guò)要上硬腦膜。之後(hòu)，繼續深入注射器道高直至到達腦實質的理想深度。
設置數字泵參數爲0.02 ml/min（0.5 ul體積在25 min内信子注射完成(chéng)）并開(kāi時員)始輸液。緩慢輸液可使病毒有效達到組織内部以防回流。
注射完成(chéng)後(hòu)，需等待5 min以保證注射物擴散到讀大大腦而不是回流到注射器中。
緩慢移出注射器。

6. 傷口縫合和恢複

用濕潤棉簽清潔注射點。較小的開(k他又āi)顱創口（小于1 mm×1 mm歌相）無需使用骨蠟；對(duì)于較大的顱骨創口，需要在顱骨表面(miàn分我)塗抹一層骨蠟。
拉緊皮膚邊緣，在三個不同的點對(duì)皮膚進(jìn)行縫合。
將(jiāng)實驗動物安置在可進紙鐵(jìn)行溫控的籠子中直到傷口完全恢複（手湖可術後(hòu)至少2周）。然後(hòu)把動物轉移回原來的籠子。金村

病毒指南